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《生物科学综合实验》—分子生物学实验

1实验目的

1.1学习并掌握在宿主菌中扩增质粒的理论依据与操作方法。了解大肠杆菌质粒提取的原理

和方法，掌握小量快速提取法（试剂盒法）。

1.2学习并掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。

3.了解大肠杆菌感受态细胞的制备原理，掌握制备方法。

4.以pET28a质粒转化大肠杆菌TOP10为例，学习转化的基本原理及方法。

2实验原理

2.1PET28a质粒在大肠杆菌中的扩增与试剂盒抽提

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细

胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的

游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细

胞分裂传递到后代。

基因工程用质粒都带有选择性标记序列，最常用的的选择性标记是对抗生素的抗性基因。如本

r

实验所使用的质粒（pET28a），即带有抗卡那霉素（Kan）抗性基因。当培养中含有卡那霉素时，

宿主（大肠杆菌BL21）的蛋白质合成受到抑制，而pET28a质粒可自行复制，从而将大大增加拷贝

数，达到抽提质粒的浓度要求。

图1pET-28a质粒基因结构简图

一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和

裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、

煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱

基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异

来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变

性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍

会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质

粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链

彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒

DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质

-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。

2.琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多

孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有

含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度

取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分

子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，

而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起

进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。

在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络

合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。

一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。本实验介绍琼脂糖凝胶

的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。

3,在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质

粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个

细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态

以摄取外源DNA。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl和RbCl（KCl）法，RbCl