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超声联合微泡对内皮祖细胞体外增殖、凋亡及细胞周期的影响

超声联合微泡对内皮祖细胞体外增殖、凋亡及细胞周期的影响作者：

范国峰，冯毅，童嘉毅，杨芳，马根山，姚玉宇【摘要】目的：

体外探讨超声联合微泡对内皮祖细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，为进一步体内研究提供科学依据。

方法：

体外提取、分离和培养猪骨髓内皮祖细胞，随机分为对照组、超声组、超声微泡组，干预后24h分别采用CCK8检测细胞增殖活性，PI染色流式细胞仪分析细胞凋亡坏死及细胞周期。

结果：

（1）低声强超声（0.25～1.0Wcm-2）联合微泡作用下对内皮祖细胞增殖活性无明显影响；较高声强（﹥1.0Wcm-2）作用下，随声强逐渐增大，细胞增殖活性逐渐降低。

（2）与对照组比较，超声微泡组（频率1MHz,输出功率1.0Wcm-2，辐照90s）对内皮祖细胞凋亡坏死及细胞周期无明显影响，而同样条件下超声组细胞凋亡坏死明显增加，同时显著抑制细胞DNA合成。

结论：

1.0Wcm-2超声联合微泡干预内皮祖细胞对细胞增殖活性、凋亡坏死及细胞周期无明显不良影响，为进一步应用超声微泡体内干预内皮祖细胞移植的研究提供可能。

【关键词】超声;微泡；内皮祖细胞；增殖；凋亡；细胞周期药物治疗和血运重建技术的不断发展,使急性心肌梗死的病死率明显降低，但对心肌梗死后心力衰竭仍无有效的治疗手段。

内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells，EPCs）是一类能够自我增殖和分化为内皮细胞的干细胞，能促进缺血组织血管新生，增加血流灌注，改善心功能。

而超声联合微泡作用能促进组织局部动脉生成，使灌注血流增加；并且在毛细血管壁产生微孔，可能有利于细胞的靶向传输。

本实验在体外探讨超声联合微泡对EPCs增殖活性、凋亡坏死及细胞周期的影响，为进一步体内研究超声联合微泡增效EPCs治疗缺血性心脏病提供依据。

1材料和方法1．1主要试剂和设备淋巴细胞分离液FicollPaque（天津灏洋生物公司）、培养液EGM2（Cambrex公司）、纤维连接蛋白（Fn，Chemicon公司）；DiI标记乙酰化低密度脂蛋白（DiIacLDL,MolecularProbe公司）、FITC标记荆豆凝集素I（FITCUEAI，Sigma公司）；CCK8试剂盒（碧云天生物科技研究所）、PI凋亡试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；含氟碳气体脂质体微泡（东南大学生物工程材料国家重点实验室）、荧光正立显微镜（Nicon公司）、CZT3超声同步治疗仪（沈阳新乐康复医疗仪器厂）、BioRad酶标仪、FACSCalibur流式细胞仪。

1.2细胞分离、培养和鉴定于雄性中国小型猪胫骨近端抽取骨髓约20ml，加入FicollPaque分离液，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，以3105的密度接种于铺有Fn的培养瓶中，培养液用EGM2。

培养至7d左右行DilacLDL和FITCUEAI双染色，记数双阳性细胞为EPCs。

1.3EPCs的干预培养细胞分为对照组、超声组和超声微泡组3组。

实验前将培养的EPCs用胰酶消化制成单细胞悬液，摇匀后以100l（约5105ml-1）加入96孔培养板。

对照组不做干预，超声组以频率1MHz、输出功率1.0Wcm-2持续辐照90s；超声微泡组加入5l微泡（约2108ml-1），以同样超声条件作用90s。

96孔培养板固定在37℃双蒸水水槽表面，超声探头垂直置于培养板下方约8cm处，为避免超声波对邻近孔细胞的影响，隔孔接种细胞，每组8孔。

1.4CCK8测定细胞增殖活性当孔内细胞生长至60%～70%融合时,无血清培养24h，以0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0Wcm-2的不同声强超声联合微泡干预EPCs，继续培养24h后每孔加入CCK8溶液10l，37℃孵育1～2h，酶标仪上以450nm测吸光度，细胞增殖越多、越快，则颜色越深，呈线性关系。