目的基因的获得.ppt

第十章目的基因的获得第十章目的基因的获得第一节已知序列基因的克隆基因克隆基因克隆又称DNA克隆，其中的一项关键技术是重组DNA技术。重组DNA是用酶学方法，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割、重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。基因克隆的技术路线①分离制备待克隆的外源DNA片段②将靶DNA片段与载体连接，组装成杂合DNA分子③重组DNA分子转入宿主细胞④筛选重组子⑤目的基因的确认和分析一、外源DNA片段的获得A鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进一、外源DNA片段的获得一、外源DNA片段的获得

聚合酶链反应

PolymeraseChainReaction三、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术D化学合成和生化合成法1、化学合成法该法是Khorana于1967年首先发明的一种利用化学反应合成寡核苷酸链的方法。从液相合成法发展为高度自动化的DNA合成仪DNA合成仪的基本工作原理是：将要合成的DNA片段3’端的第一个核苷酸固定于不溶性载体上．然后从此核苷酸开始与另一核苷酸进行缩合反应，其后用洗涤法除去多余的反应物和副产物，再用同样的步骤与下一个核苷酸进行循环反应。每循环反应一次就接长一个核苷酸，一般一个循环只需几分钟。接长的链始终被固定在不溶的固相载体上，合成结束后，将寡核苷酸链从固相载体上洗脱下来，再进行去保护基及进一步纯化过程(图3-11)。化学合成法优缺点优点：准确性极高，合成速度较快缺点：合成的寡核苷酸链长度短(不大于80个碱基)一般用于PCR引物、寡核苷酸探针、人工接头、较小基因的合成。对于超过该法合成范围的寡核苷酸链的合成，可采用分段合成法。2、生物化学法即在体外以目的DNA片段为模扳，利用酶学反应(Klenow酶或Taq酶)，在特异引物的引导下，合成特异的DNA片段。目前最常用的方法是PCR法。生物化学法优缺点优点：合成基因效率高、速度快、特异性好。随着PCR技术的发展，现在已能合成长达几十kb的DNA片段。缺点：产物中可能有1／l0000-l／1000的错配率，也就是说，PCR产物中可能存在突变体，因此，通过PCR克隆的基因，必须通过DNA序列测定才能确认。二、目的DNA片段的克隆1、目的DNA片段与载体的连接（1）DNA连接酶：两种常见的DNA连接酶的来源、性质、功能。（2）连接方式全同源粘端：外源DNA片段两端与载体DNA片段两端具有完全相同的同源互补粘端，它们之间的连接称为全同源粘端连接。定向克隆：是使外源DNA片段定向插入到载体分子中的一种连接方式，它对于DNA末端的要求是载体DNA分子的两个末端不能互补，而只能与外源DNA分子的相应末端连接。定向克隆的技术路线质粒载体用BamHI和HindIII消化-〉产生BamHI和HindⅢ的粘性末端-〉与BamHI和HindIII所切出末端相匹配的外源DNA片段相连接外源基因只能以一个方向连接于载体中：外源DNA片段的两端位点不同，线性DNA(载体或外源DNA片段)的两个非互补粘端自身环化的几率显然会大大降低。图3-12定向克隆2、重组DNA分子转入宿主细胞的方式（1）转化转化(transformation)指质粒DNA导入细菌的过程。在体外连接组装而成的DNA重组分子只能转入合适的受体细胞，才能大量地进行复制、增殖和表达。其转入方式随载体的不同而不同。(1)化学法转化CaCl2法于1972年由Cohen等人首创。基本原理：①感受态制备：使细菌处于0℃、二价阳离子(如Ca2+、Mg2+等)低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，处于感受态；②转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面③经42℃短时间热冲击，细胞吸收DNA复合物④在丰富培养基中生长数小时后，球状细胞复原并增殖该方法的转化效率可达105一106个转化子／ugDNA。可广泛应用于常规的基因克隆。(2)电击法转化(electroporation)也称电穿孔法，该法最初用于将DNA导入真核细胞，自1988年起就被Dower等人用于转化大肠杆菌。基本原理：利用高压脉冲，在宿主细胞表面形成暂时性的微孔，质粒DNA乘隙而入，在脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，质粒复制。特点：操作简单，不需制备感受态细胞，适用于任何菌株。其转化效率极高(一般可达109-1010个转化