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酵母表面展示T载体构建及目的蛋白的表面展示

摘要：构建一种能对PCR产物进行直接克隆并展示于酵母表面的新型T载

体。根据酵母表面展示载体pYD1多克隆位点序列设计出利用两端带有XcmI

内切酶酶切位点的含有黄色荧光蛋白基因的XcmI酶切盒，通过NheI和XhoI

酶切位点插入到pYDl裁体上形成质粒pYD-YFP，并对其进行酶切鉴定和DNA

测序分析，再经Xcml酶切后形成两端带有dT的表面展示T载体。利用PCR

扩增两个含有荧光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-DsRed的基因并直接克隆

到所构建的T载体中，检测其表达功能。酶切鉴定和DNA测序结果显示

PCAD-CFP和PSR-DsRed正确插入载体上，分别转化至酿酒酵母EBY100中，

激光共聚焦显微镜下观察到相应的荧光的酵母，表明克隆有融合蛋白基因片段的

载体成功在酵母细胞中进行表面展示，证明了所构建的酵母表面展示T载体具

有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。

关键词：T栽体：酵母表面展示；真核表达：XcmI酶切盒

酵母表达系统具有培养成本低廉、便于大规模培养和培养周期短等特性，同

时又具有真核生物的蛋白翻译后修饰功能，近年来逐渐用于药用和食用蛋白的生

产。酵母表面展示技术（yeastsurfacedisplaysystem）在20世纪90年代初开始兴

起，是-种将外源蛋白质进行固定化表达的真核展示系统.广泛应用于蛋白质的相

互作用、抗体研制、蛋白分子定向等领域，特别在生物乙醇生产过程中起到关键

作用，包括淀粉酶、纤维素酶等酶蛋白均已进行表面展示。a凝集素和α凝集

素是锚定在细胞壁上的甘露糖蛋白，介导单倍体交配型（MATa）和（MATα）

的识别和粘附。最常见酵母表达系统为a凝集素展示系统和α凝集素展示系统，

a凝集素由两个亚单位Agalp和Aga2p组成，由于Agalp亚基通过与细胞壁上的

β葡聚糖的共价连接而锚定在细胞壁，Aga2p和Agalp两个亚基通过两对二硫键

相连，因此a展示系统是将a凝集素的Aga2p亚基与目的蛋白进行融合，在信号

肽的引导下实现酵母的表面展示。α凝集素展示系统则将目的蛋白与α凝集素融

合，从而将其展示于酵母细胞表而。其中酵母表而展示主要采用的宿主菌是酿酒

酵母（Sacclzaromycescerevisiae），已被FDA列为CRAS（Generallyregardedas

safe）原材料.酿酒酵母表面展示能够把日的蛋白与凝集素功能结构域融合，将目

的蛋白表达并定位于酵母细胞膜的表面，不但易于纯化鉴定，并且酵母具有真核

生物的翻译后修饰体系，能表达具有一定活性的真核生物的蛋白。相比细胞内表

达的酶.酵母表面展示可多次生产展示于细胞表面的蛋白，并且在廉价的培养基

中培养可达到很高的细胞密度，适应工业生产需求，省去酶的纯化和固定化等繁

琐步骤。

构建酵母表而展示载体是蛋白质进行酵母表面展示的基础，PCR产物克隆

需耗费大量的时间与精力在表达载体的构建、质粒的提取和重组子的鉴定上，而

利用T载体可对PCR产物进行快速有效的克隆，因此有必要构建一个可直接对

PCR产物进行克隆和表达的酵母表面展示T载体，特别是进行大量的PCR产物

克隆时，可以极大减少实验操作的步骤。