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切应力对内皮祖细胞体外功能和内皮修复能力的影响

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杨震姚顺苏晨张小宇陶军

摘要：目的本研究旨在观察切应力对内皮祖细胞体外功能和内皮修复能力的影响，以探讨切应力介导细胞修复血管损伤的可能性。方法分离培养及鉴定外周血内皮祖细胞，予以低切应力（5dyn/cm2）、中切应力（15dyn/cm2）和高切应力（25dyn/cm2）处理，并观察不同水平和时间切应力对内皮祖细胞体外功能和修复血管损伤能力的影响。结果切应力处理后，内皮祖细胞的迁移、黏附和增殖功能明显增加，并且这种作用呈时间和剂量依赖性。将内皮祖细胞移植至裸鼠血管损伤模型，经切应力处理后的内皮祖细胞能更有效的加快损伤血管再内皮化，修复血管损伤。结论切应力显著增加内皮祖细胞体外功能和内皮修复能力，表明切应力介导的细胞疗法是修复血管内皮损伤的有效策略之一。

关键词：内皮祖细胞；切应力；血管损伤；再内皮化；内皮修复

近来研究表明，来源于骨髓、脐血、外周血，具有特定细胞表面标志物的内皮祖细胞（Endothelialprogenitorcells，EPCs）能够分化为内皮细胞，并能够加速血管再内皮化、修复血管损伤及参与血管新生，是干细胞移植疗法修复血管内皮损伤重要的种子细胞。研究表明，存在心血管病危险因素和冠心病发生时，循环内皮祖细胞功能和数量受损，反映血管内皮损伤修复能力下降[1-2]，因此，有效改善内皮祖细胞功能是修复内皮损伤和防治冠心病等心血管疾病的重要措施。

现普遍认为切应力是在血管内皮顶端由血流产生的摩擦力，介导内皮细胞很多功能蛋白的基因表达以及对血管的内皮稳态具有有利影响。最近研究发现，切应力促进内皮祖细胞增殖、分化到成熟内皮细胞。我们前期研究表明切应力促进人EPC的t-PA、eNOS和SOD表达，并提高体外高通畅率的EPCs种植的小径人工血管的抗血栓生成能力，表明切应力对血管内皮的有利效应是基于EPC功能的改善。切应力可增加内皮祖细胞的抗血栓形成能[2]，是改善EPCs功能活性的一种非药理学的重要手段。

1资料与方法

1.1材料与试剂EGM-2培养基购于Clonetics公司，纤维连接蛋白购于HematologicTechnologies公司，PBS购于InvitrogenGibcoTM公司，ac-LDL购于MolecularProbes公司，Lectin购于Sigma公司，VWF免疫荧光抗体一抗购于Serotec公司，，FLK-1免疫荧光抗体一抗购于Neomarker公司，8～10周龄雄性无胸腺乳鼠NRMInu/nu，购于上海斯莱克实验动物中心。

1.2细胞分离培养和早期EPCs鉴定取健康成人外周血（N=6）约40ml置于肝素管中，并以PBS稀释。加入Ficoll-Pague分离液后离心约2000rpm20min，小心提取血清和Ficoll分离液交界处的单个核细胞层，PBS洗涤两次，置于以纤维连接蛋白预衬的EGM-2培养基中。将上述含有外周血单个核细胞的培养基置于含有5%CO2、37℃孵箱中培养，培养4d后，洗去不贴壁细胞，贴壁细胞则培养第7d后用于实验。

免疫荧光标记鉴定：细胞培养2w后取一部分贴壁细胞在一定浓度ac-LDL溶液中孵育1h，然后以20ml/L的4%多聚甲醛固定，以一定浓度lectin抗体溶液孵育1h，并置于荧光显微镜下观察拍片，红色和绿色双染色细胞为EPC。

1.3切应力实验胰酶消化EPC后种植于小径聚氨酯人工血管，置于两端密闭的试管中，以6r/h的速度均匀铺垫1d，之后将制备的人工血管接装于体外切应力处理灌流装置上，分为静态组、低切应力组（5dyn/cm）、中切应力组（15dyn/cm）和高切应力组（25dyn/cm）4个不同处理组予以处理（n=6）。附着的EPC置于5，15，25dyn/cm2的切应力处理24h或以15dyn/cm2条件分别处理5，10，20h。切应力通过等式T=6Qu/bh2计算，T为切应力，Q为流量，u为介质粘度，b为通道宽度，h为通道高度。对照组的EPCs均维持在静态环境。所有实验都在37℃二氧化碳培养箱中进行。

1.4内皮祖细胞体外功能检测EPCs迁移功能：将含50ng/mlVEGF的DMEM培养液加入改良Boyden小室的下室，用2.5g/L胰酶消化贴壁细胞，悬浮于DMEM培养液中。将含50ng/ml悬浮在500ulDMEM培养液注入上室，培养24h后，轻轻刮去滤膜上面的未迁移细胞，用甲醇固定，Giemsa溶液染色，计数迁移的细胞。

检测EPCs增殖功能：EPC培养7d后，如上述用0.25%胰酶消化贴壁细胞，悬浮于DMEM培养液中。将相同数量的EPC接种到包被有人纤维连接蛋白96孔培养