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CRISPR技术操作指南
十年前,当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为CRISPR
结构的时候,他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴.在
过去的这一年半时间里,CRISPR方法已迅速席卷了整个动物王国,
成为DNA突变和编辑的一种马上技术——迄今为止在几乎每种
实验细胞类型中都能起作用,包括人类细胞,小鼠,斑马鱼和果蝇细胞；
这种技术也易于操作,已经有两个研究组利用CRISPR分析了人类
细胞中几乎每个基因单突变〔详细报道Science：CRISPR/Cas9加
速基因挖掘；Science：张峰建立CRISPR/Cas9人细胞敲除体系〕.
就在最近,CRISPR还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断〔gene
disruptions〕的工程猴,这项壮举此前曾在小鼠中实现过,但未在灵长
类动物中完成过〔详细报道Cell：中国科学家利用CRISPR/Cas9
技术构建基因工程猴〕.
CRISPR本身是一种防御系统,用以保护细菌和古细菌细胞不受
病毒的侵害.在这些生物基因组中的CRISPR位点能表达与入侵病
毒基因组序列相匹配的小分子RNA.当微生物感染了这些病毒中的
一种,CRISPRRNA就能通过互补序列结合病毒基因组,并表达
CRISPR相关酶,也就是Cas,这些酶都是核酸酶,能切割病毒DNA,
阻止病毒完成其功能.
将CRISPR/Cas系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：
一个Cas酶,用于切断靶标DNA,比如目的基因中的DNA片段,另
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外一个就是称为导向RNA〔gRNA〕的RNA分子,这种分子能通
过互补结合靶标.gRNA也就是细菌细胞中CRISPRRNA的一个更
短的版本,它能与Cas形成复合物,指导Cas到达正确的剪切位点.
不过研究人员也可以通过结合其它元件,或者改变Cas活性,来调整
这种工具在基因校正和基因调控方面的作用.
目前,非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具,分
析细胞中,和整个生物机体中突变的作用,来自加州大学伯克利分校
的生物化学教授JenniferDoudna表示,她与她的同事解析了细菌细
胞中CRISPR的作用机制.近期,Doudna研究组利用这种工具,首次
通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠.
不过CRISPR技术也存在一个主要的缺点,那就是缺乏特异性：
一些gRNA分子结合的DNA只是部分与gRNA互补.在这一方
面,其它基因编辑方法,如锌指核酸酶〔ZFN〕和TALENS可能要比
Cas-gRNA更为具有优势,因为这两者需要识别更长的靶标DNA
序列.但是ZFN和TALENS方法在克隆和细胞表达方面要比
gRNAs难得多,而且研究人员通常还需要验证十几个不同的
TALENS,以与几十个不同的ZFNs,来证明其中一个有效.
近期《科学家》〔TheScientist〕杂志汇总了基因编辑过程中Cas
和gRNA的处理过程与解决方案,用于帮助新接触这一技术的研究
人员熟悉这项热门技术.
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