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细胞培养基本知识

;合适的环境和必需的条件;环境要求;实验室：;1?级?基础实验室——

一级生物安全水平基础的教学、研究,GMT?不需要；开放实验台;?典型的二级生物安全水平实验室

门保持关闭并贴上适当的危险标志。

潜在被污染的废弃物同普通废弃物隔开。

基本生物安全设备

1?.移液辅助器—避免用口吸的方式移液

2?.生物安全柜，在以下情况使用：

—?处理感染性物质；如果使用密封的安全离心杯，并在生物安全柜内装样、取样，则这类材料可在开放实验室离心

—?进行极有可能产生气溶胶的操作时（离心、研磨、混匀、剧烈摇动、超声破碎、打开内部压力和周围环境压力不同的盛放有感染性物质的容器、动物鼻腔接种以及从动物或卵胚采集感染性组织）。

3.一次性塑料接种环；也可在生物安全柜内使用电加热接种环，以减少生成气溶胶。

4?.螺口盖试管及瓶子。

5?.用于清除感染性材料污染的高压灭菌器或其他适当工具。

6?.一次性巴斯德塑料移液管，尽量避免使用玻璃制品。

7?.在投入使用前，像高压灭菌器和生物安全柜等设备必须用正确方法进行验收。应参照生产商的说明书定期检测。

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;传染病原危害等级。

第一级危害群微生物：

与人类成人健康和疾病无关；（无或极低的个体和群体危险）不太可能引起人或动物致病的微生物

第二级危害群微生物：

在人类所引起的疾病很少是严重的，而且通常有预防及治疗的方法；（个体危险中等，群体危险低）实验室暴露也许会引起严重感染，但对感染有有效的预防和治疗措施，并且疾病传播的危险有限。

第三级危害群微生物：

在人类可以引起严重或致死的疾病，可能有预防和治疗方法；

第四级危害群微生物：

在人类可以引起严重或致死的疾病，通常无预防和治疗的方法，如炭疽杆菌、霍乱弧菌、埃博拉病毒、天花病毒等。

;无毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与

细胞直接或间接接触的东西都必须

是无毒的。

;废弃物处理;实验设备及用品：

超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸

CO2培养箱

倒置显微镜

酶标仪、微孔板震荡器

液氮罐

自动双重纯水蒸馏器，纯水仪

耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管

;CO2培养箱;自动双重纯水蒸馏器纯水仪;滤器;培养板及瓶;实验准备;清洗;玻璃器皿的清洗基本方法;刷洗：

用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质

刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度;浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中

清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质

浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面

浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时

清洁液常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）

强清洁液63∶1000∶200

次强清洗液120∶200∶1000

弱清洁液100∶100∶1000

配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分

配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色

;冲洗

在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹

最好用洗涤装置

如用手工操作

需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5次，晾干备用;胶塞的清洗;塑料制品的清洗;消毒;消毒灭菌方法;细胞培养基应用选择;制备1000mlRPMI?1640培养基;消化液;胰蛋白酶溶液：

胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。

胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。

用含血清培养液终止其对细胞的消化作用;胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks平衡盐溶液（常用浓度为0.25%（0.1%-0.5%））搅拌混匀，置室温4小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡

次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，-20℃保存备用（以免分解失效），

胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调pH至7.2左右;D-Hanks’平衡盐溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS);EDTA·4N