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绵羊体外胚胎生产技术规程

1范围

本文件规定了绵羊体外胚胎生产过程中的卵母细胞体外成熟、体外受精和早期胚胎体外培养等内容。

本文件适用于绵羊体外胚胎生产程序。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T1571羊胚胎移植技术规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

体外成熟invitromaturation（IVM）

卵母细胞在体外恢复减数分裂并发育到第二次减数分裂中期（MII）这一过程，经历细胞核成熟和细胞质成熟。

3.2

体外受精invitrofertilization（IVF）

哺乳动物的精子和卵子置于适宜的培养条件下使之完成受精的一种技术。

3.3

体外培养invitroculture（IVC）

将受精卵置于适宜的培养条件下使其发育至囊胚期。

4体外胚胎生产培养液配制

采卵液、体外成熟培养液（IVM液）、受精液（IVF液）和胚胎发育液（IVC液）配方见附录A。

5操作前准备

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打开实验室和超净工作台紫外灯，照射20min后用酒精擦拭消毒；关闭实验室紫外灯30min

后，操作人员将双手清洗干净后，穿戴工作服、口罩、手套、帽子等，更换拖鞋进入实验室，并随手关闭实验室门；用75%酒精喷洒消毒双手；实验室工作台、显微镜以及加热台面用酒精擦拭消毒，并且将加热台打开预热。

6卵母细胞体外成熟

6.1准备工作

6.1.1拣卵针

用酒精灯将采卵用玻璃管拉制成口径适宜的捡卵针，管口在火焰上烧圆钝。

6.1.2制作成熟液滴

实验开始前使用35mm培养皿制作卵母细胞成熟液滴（100μL成熟液滴，覆盖3.5mL矿物油），并放入5%二氧化碳培养箱内平衡2h以上。

6.2检卵

采卵液于37℃恒温板上提前预热。将含有卵母细胞的采卵液置入60mm的培养皿。在体式显微镜下从左到右、从上到下的顺序仔细挑选，将捡出的卵母细胞放置于盛有采卵液的35mm培养皿中，用成熟液洗涤3次。

7体外成熟

将洗涤好的卵母细胞按15枚/100μL～20枚/100μL液滴的密度，移入成熟液滴中，后放入二氧化碳培养箱培养22h～24h。培养条件：5%CO2、95%空气、38.6℃、饱和湿度。

8卵母细胞体外受精

8.1准备工作

体外受精实验开始前，在5%二氧化碳培养箱内，平衡受精液（IVF液）2h～3h；38.6℃预热0.2%的透明质酸酶工作液。

8.2体外受精

8.2.1精液选择

选择体外受精效果好的精液，并根据体外成熟卵母细胞的数量计算所需的精液量。8.2.2精液解冻

如使用冷冻精液，将所需精液置于37℃~40℃水浴解冻。

8.2.3精液检查

取约3μL精液置于载玻片上，盖上盖玻片后，显微镜下检查精子活力和密度。

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8.2.4精子上游

将试管架置于37℃加热台上，移液枪吸取约100μL精液，缓慢注入装有500μL受精液的试管底部，后置于38.6℃、5%CO2培养箱内上游30min。

8.3卵母细胞处理

将体外成熟培养22h～24h的卵母细胞取出，观察卵母细胞成熟情况，记录卵丘细胞扩展情况；用移卵针将全部卵母细胞移入预热的0.2%透明质酸酶液滴中，轻吹直至剩余2～3层卵丘细胞，使用受精液洗涤3次。将洗涤后的卵母细胞按50枚/500μL～60枚/500μL受精液（四孔板）或15枚

/100μ~20枚/100μL受精液的密度移入受精液中。

8.4体外受精

将上游30min后的精液从培养箱中取出，用移液枪沿试管壁从每管上游液中吸取200μL～300

μL上清液加入提前预热好的离心管中，1500r/min离心4min后弃掉上清液，剩余约30μL～50μL精子沉淀液，轻轻混匀。用移液枪吸取精子沉淀液，倾斜枪头从边缘插入受精液滴或孔，对准卵母细胞后吹出精液，精液浓度调整至1×106个/mL～1×107个/mL，后置于38.6℃、5%CO2培养箱内孵育20h。

9体外培养

预先将绵羊胚胎体外发育液（IVC液）在38.6℃、5%CO2培养箱中平衡2h以上。将体外受精20h后的胚胎取出置于IVC液内，移液枪轻吹以去除黏附的精子及全部卵丘细胞，使用IVC