临床基因扩增检验在性病实验诊断中的应用.pptx

;1985年，Kary.B.Mullis教授发明了具有划时代意义的PCR技术。

1993年，Kary.B.Mullis因该技术的发明而获得诺贝尔化学奖。;PCR反应过程;;PCR产物的电泳检测和分析;二、实时荧光定量PCR;TaqMan作用机理;普通PCR;实时荧光定量PCR应用;;;;;基线

基线（Baseline）：扩增曲线中的水平部分。;阈值线

阈值线（Threshhold）：荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。;Ct值;;报告的基本要求;标准曲线平滑均匀，相关系数、内参等参数的数值允许变

化范围均应在试剂制造商推荐的范围内。

阴、阳室内质控检测结果均处于在控状态。

以上几项标准均达到要求后，当次实验有效，可以发放报告。否则，本次实验无效。;IU与拷贝;五、临床基因扩增检验技术在性病实验诊断中的应用;标本采集、存放及运输;对于常规开展的项目应该定期进行室内质量控制。

定量与定性;;定性项目不能发定量报告;六、临床基因扩增检验管理要求;一、临床基因扩增检验实验室的设计

（一）临床基因扩增检验实验室区域设计原则。原则上临床基因扩增检验实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。这4个区域在物理空间上必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。根据使用仪器的功能，区域可适当合并。例如使用实时荧光PCR仪，扩增区、扩增产物分析区可合并；采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。

各区的功能是：

1.试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。

。标本制备区：核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作，应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。

扩增区：cDNA合成、DNA扩增及检测。

扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等;二、临床基因扩增检验实验室工作基本原则;三、临床基因扩增检验实验室各区域工作注意事项;实验室审核和设置;广西临床基因扩增检验实验室技术审核情况;实验室人员管理;设备管理;试剂和耗材有专人保管，应在有效期内使用，并按其规定的保存要求存放

实验室应对关键耗材、不同批号试剂进行验收

?外观检查：包装完整性、温度要求、有效期等

?性能验证：不同批号试剂间的差异、重要耗材的抑制物（如使用不含抑制物免检，但应有注明）; 在用于临床标本检测前，应对完整检测系统至少进行性能验证。完整检测系统包括采样液、提取试剂、提取仪、扩增试剂、扩增仪的组合。检测系统出现变更或存在多个检测系统组合的，每检测系统均应进行性能验证。

对新项目的性能进行方法学验证，并有相应的实验记录。

仪器、试剂、方法更新时应进行方法学验证，并有记录。

定量检测方法和程序的分析性能验证内容至少应包括精密度、正确度、线性、测量和/或可报告范围、抗干扰能力等。

定性检测项目验证内容至少应包括测定下限、特异性、准确度（方法学比较或与金标准比较）、抗干扰能力等。;目的：监测和控制实验室常规工作的精密度，即实验室测定的批内和批间重复性

室内质量控制结果决定了实验室即时测定结果的可靠性和有效性

凡出具临床检测报告的项目均应开展室内质控;来源:第三方、试剂盒自带、自制

使用:

1)冻干质控品复溶时，要确保所用溶剂的质量

2)冻干质控品复溶时，所加溶剂的量要准确

3)冻干质控品复溶时应轻轻摇匀，切忌剧烈振摇

4）避免反复冻融

5）室内质控应监控核酸提取、扩增、产物分析等标本检测全过程;定性检测：每次实验应设置阴性、弱阳性和/或阳性质控物。如为基因突变、基因多态性或基因型检测，则应包括最能反映检测情况的突变或基因型样品，每批检测的质控至少应有一种基因突变或基因型。

弱阳性质控：监测核酸提取和扩增检测的有效性

阴性质控样本：判断核酸提取过程中是否发生污染(实验室的以前扩增产物的污染、标本间的交叉污染、强阳性标本气溶胶经加样器导致污染、强阳性标本经操作者手导致污染翻盖离心管在较高温度温育时盖子崩开、扩增反应试剂的污染）

定量检测：每次实验应设置阴性、弱阳性和阳性质控物。;室内质控品在扩增仪中的排列顺序：不宜固定位置,尽可能监测每一个孔扩增有效性

板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控：在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中