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大肠杆菌分离鉴定及药敏实验方案--第1页

鸡致病性大肠杆菌的分离培养及药敏实验

实验基本步骤：样品→肝、脾触片革兰氏染色镜检→普通琼脂平板、麦康凯

琼脂平板分离培养→革兰氏染色镜检、生化实验鉴定→普通肉汤培养基增殖培养

→药敏实验。

1病料采集

1.1准备材料：试管、载玻片、手术刀、手术剪、结扎绳、记号笔、冰块、泡沫

箱、口罩、手套（该灭菌的都进行高压蒸汽灭菌）、冰箱。

1.2取材部位：血液、肝脏、脾脏、肠内容物，若有鸡胚感染则去鸡胚及卵黄物。

1.3操作方法：将病死鸡浸泡在消毒剂溶液中，打开腹腔，无菌采集肝脏、脾脏

放于事先准备好的灭菌试管内，将带有肠内容物的肠管两端结扎放于灭菌是试管

内。将有明显病变的脏器入肝、脾进行触片，做好标记。都贴上标签，标示采集

样品，来源地，采集时间，采集人。将装有病料的试管放在放有冰袋的泡沫箱中，

及时返回实验室，置于4℃冰箱待检。

2菌的分离培养及鉴定

2.1准备材料：光学显微镜、革兰氏染色液、载玻片、手术刀、接种环、平皿、

恒温箱、高压锅、摇床、酒精灯、葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等微量生化发酵

管，蛋白胨水（蛋白胨(或胰蛋白胨)20g、氯化钠5g、蒸馏水1000mLpH7.4），

葡萄糖蛋白胨水溶液（每100mL蛋白胨水中加入葡萄糖1g）、甲基红试剂、吲

哚试剂、乙醚、VP指示剂、超净台。

培养基：

A.普通琼脂培养基（牛肉粉3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水

1000ml，ph7.3±0.1），

B.麦康凯琼脂培养基（蛋白胨20g、牛胆盐5g、氯化钠5g、琼脂15g，乳糖10g、

结晶紫0.001g、中性红0.025g，ph7.2±0.2。），

C.营养肉汤培养基（牛肉粉3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，ph7.2

±0.2）。

2．2样品触片镜检

涂片镜检：取触片,进行革兰氏染色镜检。

2.2.1在玻片上滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1min，水洗。

2.2.2加革兰氏碘液于玻片上媒染，作用1min，水洗。

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2.2.3再加95%酒精脱色，作用15～30s，水洗；加番红复染液复染1min，水洗，

自然干燥后镜检，观察细菌染色与形态。

结果鉴定：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。可见革兰氏阴性,

两端钝圆、无芽胞、单个散在的短杆菌。

2.3菌的分离培养

以无菌操作的方法，将灭菌后的外科手术刀片烧烙脏器被膜后，再用接种环

刺入脏器实质取样做分离培养。分别接种在普通琼脂平板和麦康凯琼脂平板，

37℃恒温培养24h，然后观察，同时进行革兰氏染色镜检。

结果鉴定：在普通琼脂平板上生长菌落较为一致,直径2mm左右,菌落呈圆

形、凸起、湿润、半透明、灰白色;在麦康凯平板上生长出红色、中等大小、圆

形的菌落。

2.4革兰氏染色镜检

用接种环挑取一环生理盐水蘸于洁净玻片上，再用接种环挑取少量麦康凯琼

脂平板上培养2Oh的新鲜菌落,光滑、砖红色的单个菌落与玻片上的生理盐水混

合，并均匀涂布于玻片上，将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，

水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至

染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；滴加番红染液，复染1min，水洗、待干、

镜检。

结果鉴定：经镜检可见到呈红色的革兰氏阴性菌，两端钝圆，短小杆菌，偶

有