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葡萄组培脱毒育苗技术规程

1范围

本文件规定了葡萄组培育苗过程中的外植体选择、热处理、外植体消毒、茎尖剥离、初代培养、增殖培养、生根培养、病毒检测、炼苗移栽、苗木质量控制等内容。

本文件适用于葡萄组织培养脱毒育苗技术。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T15981NY469

NY/T2377

消毒器械灭菌效果评价方法葡萄苗木

葡萄病毒检测技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

组培苗tissuecultureseedling

根据植物细胞具有全能性理论，利用外植体，在无菌和适宜的人工条件下，培育的完整植株。

3.2

外植体explant

植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。

4外植体选择

选择品种纯正、生长势强、无病虫害的葡萄母株，采集带有腋芽的嫩茎3~5cm茎段作为外植体，采样最佳时间为早上10点以前。

5热处理

采集的外植体插在装有营养液的三角瓶中，置于37℃条件下培养14h/d，25℃条件下培养10h/d，培养20～30d。

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6外植体消毒

将外植体去除叶片和叶柄，剪成长度在3cm左右的茎段。茎段用自来水冲洗15min后，转入超净工作台，用75%酒精浸泡30s，再用无菌水冲洗3遍，然后用10%次氯酸钠溶液或0.1%升汞溶液浸泡8～10min（期间不断摇晃瓶子，使消毒液和茎段充分接触），最后用无菌蒸馏水冲洗5遍。消毒所用器械的灭菌参照GB/T15981。

7茎尖剥离

将灭菌后的茎段在灭菌的滤纸上吸干水分，置于解剖镜下，进行茎尖剥离。剥离出的茎尖大小为0.3~0.5mm。将剥离的茎尖快速接种于灭菌的初代培养基上。

8初代培养

8.1初代培养基

基本培养基为MS培养基，添加1.0mg/L6-苄氨基嘌呤，0.05mgα-萘乙酸，20～30g/L蔗糖，5～7g/L琼脂粉，pH调至5.5～6.0。

8.2培养条件

接种瓶苗置于温度20～25℃,湿度60～80%，光照强度1500lx～2000lx，8h光照，16h黑暗。

9增殖培养

在培养50～60d后，取高度为1cm左右的葡萄新芽，将其转接到增殖培养基上。9.1增殖培养基

基本培养基为MS培养基，添加1.0mg/L6-苄氨基嘌呤，0.1mgα-萘乙酸，2.0mg/LPVP，20～30g/L蔗糖，5～7g/L琼脂粉，pH调至5.5～6.0。

9.2培养条件

接种瓶苗置于温度20～25℃,湿度60～80%，光照强度2000lx～2500lx，12h光照，12h黑暗。

10生根培养

当继代培养的组培苗高约2cm时，即可将其转接到生根培养基上。10.1生根培养基

基本培养基为1/2MS培养基，添加0.2mgα-萘乙酸，0.2g/L活性炭，20～30g/L蔗糖，5～7g/L琼脂粉，pH调至5.5～6.0。

10.2培养条件

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接种瓶苗置于温度20～25℃,湿度60～80%，光照强度2000lx～2500lx，16h光照，8h黑暗。

11病毒检测

经过脱毒处理的葡萄组培苗长至8～10cm时，对其进行病毒检测，检测病毒种类及检测方法参照NY/T2377的规定。检测结果为阴性时，确定该植株为葡萄组培脱毒苗。

12炼苗移栽

12.1炼苗

当根的长度达到1.0cm左右时，将生根良好的试管苗转移到室温条件下放置5～7d，然后打开瓶盖继续放置2～4d。

12.2移栽

移栽时，将组培苗根部附着的培养基清洗干净，移入装有基质的穴盘中。移栽在晴天的傍晚或阴天进行。

12.3水肥管理

移栽7d内，保证土壤持水量在70%～90%，每天喷雾浇水2次。7d～14d，保证土壤持水量在50%~70%。之后的水肥管理按葡萄正常管理进行。

13苗木质量控制

苗木质量标准、检测方法、出圃、包装等参照NY469执行。