检测蛋白质中氨基酸的含量的各种方法及优劣讨论.pdfVIP

蛋白质中氨基酸的含量测定

组成蛋白质的基本单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链。蛋白质

是由一条或多条多肽链组成的生物大分子，其含量测定是生化药品研究中最常

用、最基本的分析方法之一。

目前其常用的测定方法有凯氏定氮法、福林酚法、双缩脲法、BcA法、考马

斯亮蓝法、紫外分光光度法及荧光法。

1凯氏定氮法

1．1

方法本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物，当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾

一同加热消化时使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸

馏使氨游离，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量乘以氮转化

为蛋白质的换算系数，即为蛋白质的含量。本法各国药典收载的方法一致。故

参照《中国药典》2005年版三部[41附录方法，按纯蛋白类供试品及添加无机

含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品分别拟定各测定方法。

1．2讨论

1．2．1

凯氏定氮法虽耗时较长，但它是蛋白质测定方法中最经典的测定方法，本

法所测的结果为蛋白质绝对浓度而非相对浓度，可用于标准蛋白质含量的准确

测定。

1．2．2

本法灵敏度较低，适用于O．2～

2．omg氮的测定，干扰少。

1．2．3

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蛋白质是复杂的含氮有机化合物，一般蛋白质的含氮量为16％，故含氮量

转化为蛋白质的系数为

6．25。但由于不同蛋白质的结构差异，其换算系数会稍有区别，如乳制品

为

6．38，动物胶为5。65等，因此一些特殊蛋白质应在各论中相应说吩其转

化系数。

1．2．4

在本法附注中起草了非蛋白氮供试品溶液制备的两种常用方法用于非氮的

测定，一般采用钨酸沉淀法，但当供试品中含有氨基酸(精氨酸)时，由于其会影

响蛋白质的沉淀，故建议采用三氯醋酸沉淀法

方法

(1)与方法

(3)的线性相关系数均能达到

0．999以上，较理想；方法

(1)试剂配制繁琐且整个实验费时长，而方法

(3)操作更简便快速。按各方法测试后的溶液放置30min后重新测定其吸光

度，3种方法溶液的吸光度均略有降低，结果变异均在1％以内。根据上述考察

结果，故本文参照《国家药品标准》地标升国标制定本法。

2xx酚xx(lowryxx)

2．1

本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白

质．铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱

性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应，在

一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲

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线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。本法各收载的方法中碱陛铜试液

的配制、福林酚试液的酸浓度、测定波长及比色条件略有不同。本文对各种方

法的线性、稳定陡进行了考察。

2．2讨论

2．2．1

本法福林酚试液中使用的福林试液贮备液的配制在《中国药典》二部附录

中有收载，其酸浓度为2m

01．L～，目前也有市售产品，但酸浓度可能有所差异，故应根据实际福林

试液贮备液酸浓度的高低对最终福林酚试液的配制进行调整。

2．2．2

福林-酚试液仅在酸性pH条件下稳定，但第二步的还原反应只在pH=10的

情况下发生，故当酚试剂加到碱性铜一蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便

在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生，否则会使显色程度减

弱。

2．2．3本法干扰物质较多，还原物质、酚类、柠檬酸、硫酸铵、％s缓冲

液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。

2．3．4本法灵敏度高，比双缩脲法高100倍，通常测定范围为20～

250“g。

3双缩腺法

3．1

本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与cu2+形成紫

红色络合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品

溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。本法各收载的方法

中双缩脲试液的配制、测定波长及比色条件略有不同。本文对各种方法的线

性、稳定