分子杂交及相关技术.pptVIP

第二节分子杂交及相关技术分子杂交,标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。分子杂交包括：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。双链probe或DNA解链，主要取决于:1．链的长度:链越长，需要的能量多才能解链；2．碱基成分:GC含量高，较难变性；3．化学环境:单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链是指一段目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的核苷酸序列。Probe可以是整个基因,或是基因的一部分,是DNA,也可以是RNA。（一）制备特异性探针所需要的基本条件1.被检基因结构清楚；2.有明确的基因产物;3.已知某一基因产物对表型的反应或缺少某一基因对表型的反应。具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。（二）特异探针的来源1.基因组探针：从已建立的基因组文库中筛选和分离所需的目的基因。克隆扩增大量的DNA探针DNA克隆2.cDNAprobe:从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因探针。3.寡核苷酸探针克隆（clone）:是指用无性繁殖的方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。根据已知基因序列,人工合成一段互补的DNA片段。一般长约15～50个bp。多数探针的制备都通过分子克隆的方法获得。二、探针的标记将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。常用于标记探针的标识物:同位素:32P,35S,3H-dNTP等；非同位素:地高辛-dNTP，生物素-dNTP。常用的标记方法:1.缺口平移法（NickTranslation）原理及过程:反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I5’→3’外切酶活性，在缺口处按5’→3’方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5’→3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP,DNA酶I,DNA聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP2.随机引物法（6核苷酸引物标记法）原理及过程:利用E.coliDNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5’→3’聚合酶活性。被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为起点，沿模板3’→5’方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。随机引物标记探针5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP变性-复姓一、DNA杂交常用的方法（一）.Southernblot1975年，英国科学家Southern首创，是指DNA-DNA杂交，是经典的基因分析方法。1.原理和步骤:提取T、CellDNA限制酶消化DNA片段电泳分离变性转移至尼龙膜变性、杂交洗膜、放射自显影、结果分析SouthernBlot2.应用:(1)基因组结构分析:如缺失、插入、倒位等的检测(2)RFLP连锁分析(二).斑点杂交

(dotandslothybridization)鉴定核酸序列的简便方法。1.原理及步骤：提取T、CellDNA↓点样品至膜、干燥、固定↓探针、DNA变性、杂交↓洗膜、放射自显影