酶促反应动力学(有方程推导过程).ppt

2.酶的纯化：纯化的关键是维持酶的活性，因为随着酶的逐渐提纯，一些天然的可保持酶活力的其它成分逐渐减少，酶的稳定性变差，所以整个纯化过程应维持低温。（1）酶的沉淀方法：与蛋白质的沉淀方法相同，常用：①盐析法：常用硫酸铵盐析，有分段盐析和一次性盐析两种方法。②有机溶剂沉淀法：用乙醇、丙酮等。应低温操作，溶剂少量分批加入。③等电点沉淀法第53页,共82页，星期六，2024年，5月（2）酶的纯化方法：有吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等.3.酶的结晶：纯化以后的酶液再次沉淀，仍采用沉淀法。4.酶的保存：一般在-20℃以下低温保存。第54页,共82页，星期六，2024年，5月二、酶活力的测定定性鉴定提取物中某一酶是否存在，一般是根据此酶引起的化学反应来判断，如检验在提取物中是否存在淀粉酶。则用提取物与淀粉反应，一段时间以后，用碘-碘化钾与反应液反应，若变蓝，说明提取物无淀粉酶活力；反之，提取物有淀粉酶的活力。酶活力的测定：实际上是酶定量测定的方法，酶制剂因含杂质多易失活等原因，故不能用称重或测量体积来定量。第55页,共82页，星期六，2024年，5月（一）酶活力的概念：指酶催化特定化学反应的能力。其大小通常用在一定条件下酶催化某一特定化学反应的速度来表示。一定量的酶制剂催化某一化学反应速度快，活力大；反之，活力小。速度表示法常用-dS/dt或dP/dt，测初速度，多用后者。因为反应初期底物过量，底物的减少量不容易测定，而产物从无到有，易测定。第56页,共82页，星期六，2024年，5月（二）酶的活力单位：1961年国际生化协会酶学委员会统一规定，酶的国际单位（IU）规定为：在最适反应条件（温度25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量（或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量）称为1标准单位。测定条件：最佳的反应条件，如最适的T（或25℃）、最适pH、[S][E]、初速度下。1972年国际生化协会又推荐一种新单位，即Katal(Kat)单位。规定：在最适温度下，每秒钟能催化1摩尔底物转化的酶量定义为1Kat。1Kat=60×106IU.第57页,共82页，星期六，2024年，5月第58页,共82页，星期六，2024年，5月(三)酶的比活力：每单位酶蛋白所含的活力单位数。对固体酶：用活力单位/mg酶蛋白、或活力单位/mg酶蛋白氮来表示；对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。很明显，比活力越大，酶的活力越大。第59页,共82页，星期六，2024年，5月（五）酶活力的测定方法1、分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质或产物有紫外吸收的能力可采用此法。2、测压法：产物中有气体，测气压增加量。3、滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。4、荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂反应生成荧光产物可用此法。5、旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。除了以上方法外，还可根据产物的性质采用其它方法。第60页,共82页，星期六，2024年，5月三、回收率和纯化倍数回收率＝×100％每次总活力第一次总活力纯化倍数＝每次比活力第一次比活力酶的回收率和纯化倍数的测定常在酶分离过程中的每个环节中进行。一个正常、合理的纯化程序，随着纯化的进行，总蛋白量逐渐减少，比活力不断增加，纯化倍数提高了，但回收率降低。第61页,共82页，星期六，2024年，5月一、变构酶与变构调节（一）按动力学分类：调节酶：凡能通过构象变化或亚基解聚或亚基修饰等方式来改变酶活性而对代谢起调节作用的酶称为调节酶。（共价调节酶、别构酶）、非调节酶变构酶又称为别构酶，指调节物与酶分子的调节部位以非共价键结合后，引起酶的构象的改变，进而改变酶的活性状态，酶的这种调节作用称为变构调节(allostericregulation)，具有变构调节的酶称变构酶(allostericenzyme)。凡能使酶分子发生别构作用的物质称为变构剂或调节物调节物能使酶活性增加的效应叫正协同效应，该调节物叫正调节物（如底物）调节物能使酶活性降低的效应叫负协同效应，该调节物叫负调节物第62页,共82页，星期六，2024年，5月通过其它酶对其多肽链某些基团进行可逆共价修饰，使处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性；共价修饰主要是磷酸化、腺苷酰化、甲基化等。如在蛋白激酶作用下发生