熊源性成分检测实时荧光PCR法.docx

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熊源性成分检测实时荧光PCR法

1范围

本文件规定了动物源性产品中熊源性成分实时荧光PCR检测方法。

本文件适用于动物源性产品（肉制品、皮毛类产品、饲料等）中熊源性成分的鉴定，灵敏度为0.01ng/μL。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.1食品安全国家文件食品微生物学检验总则GB/T5009.1食品卫生检验方法理化部分总则

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。3.1CTAB

十六烷基三甲基溴化铵3.2EDTA

乙二胺四乙酸

3.3Real–timePCR

实时荧光定量聚合酶链式反应3.4Tris-HCl

三氨基甲烷

4设备

4.1实时荧光PCR检测系统。

4.2高速台式冷冻离心机（最高转速12000rpm以上）。

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4.3离心机。

4.4旋涡振荡器。

4.5单孔道微量移液器和枪头：0.5μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。

4.6EP离心管。

4.7刻度量筒：100mL，500mL，1000mL。

4.8试剂瓶和洗涤瓶：500mL。

4.9天平。

5试剂与材料

5.1水：符合GB/T6682分析实验室二级水规格。

5.2试剂盒：按说明书使用试剂盒提供的相应试剂。

5.3自备的试剂：CTAB提取缓冲液（十六烷基三甲基溴化铵），CTAB-沉淀液，蛋白酶K（1.2mol/L）氯化钠。

5.4实时荧光预混液。

5.5引物对序列

-上游：5’-CTCAGGAATAATTCTACTAACA-3’

-下游：5’-GAGCGATTGAAGAGTATG-3’

-探针序列：5’-FAM-TCGCACCTCTATCCGTCCTATATCA-TAMRA-3’

5.6质控物质

5.6.1阳性对照样品：采用已知含有熊源性成分的样品或经测序确认的阳性质粒。

5.6.2阴性对照样品：采用已知不含有熊源性成分的样品。

5.6.3空白对照：采用与模板等体积的双蒸水。

6实验方法

6.1样品的选取与制备

动物源性食品按照GB/T5009.1和GB4789.1采样。将实验室样品研磨待用。

6.2样品DNA的提取

3

参照附录A中方法提取样品基因组DNA，也可采用商品化的组织基因组DNA提取试剂盒进行。当A260/A280比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。除检测样品外，需要设立阴性、阳性及空白对照。

6.3实时荧光PCR检测

6.3.1反应体系

反应体系体积为25μL，体系组成见表1。

表1熊源性成分实时荧光PCR检测方法的反应体系

试剂名称

贮备液浓度μmol/L

反应体系体积μL

PCR反应预混合液

—

12.5

上游引物（F）

10

1

下游引物（R）

10

1

探针（P）

10

1

模板

—

2

双蒸水

—

补足至总体积为25

6.3.2反应条件

预变性：95℃,3min；变性：95℃,15s；延伸退火：56℃,30s，40个循环。在56℃时

收集荧光信号值。

6.3.3检测过程

分别设阴性对照、阳性对照和空白对照。

7结果判定与表述

7.1质量控制

7.1.1一般要求

实验中设置的各种对照PCR检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做试验。

7.1.2核酸提取空白对照和PCR扩增试剂空白对照检测结果Ct≥40.0

7.1.3PCR扩增阴性目标DNA对照检测结果Ct≥40.0

7.1.4PCR扩增阳性目标DNA对照

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检测结果Ct≤35.0

7.2结果判断和报告

7.2.1样品2个平行样检测结果Ct≥40.0，同时各种试验对照结果正常，可以判断样品结果为阴性，报告未检出熊源性成分。

7.2.2样品至少1个平行样检测结果35.0﹤Ct﹤40.0，并出现典型的扩增曲线，同时各种试验对照结果正常，此时应适当增加DNA模板量重做实时荧光PCR检测。再次检测结果仍然Ct﹤40.0并出现典型的扩增曲线，同时各种试验对照结果正常，可以判断样品检出熊源性成分，报告检出熊源性成分；再次检测结果仍然Ct≥40.0同时各种试验对照结果正