HPLC色谱条件的优化与色谱PPT课件.pptVIP

HPLC色谱条件的优化

与色谱技术进展;一、分离度方程式;混合物中不同组分在两相间平衡分配性质的

差异是色谱分离的基础，研究物质平衡分配的内

容属于色谱热力学的范畴。

容量因子K决定了组分的保留时间，而分离因

子α决定了组分的分离选择性。这二个重要的色

谱参数都取决于溶质、固定相和流动相的热力学

性质。在溶质、固定相和流动相的某种组合下，

只要不同组分的平衡分配性质存在差异，而且这

种差异又足够大时，就有可能实现分离。;

要使分离的可能性变为可行，则必须设法控制色谱过程中使色谱峰发生展宽的各种外在因素。色谱峰的展宽主要决定于柱填料的性质以及填装质量，例如填料颗粒大小、粒径分布、形状、表面积、孔径、孔体积，等等。研究柱效与各种影响因素的关系是色谱动力学的内容。;1、Rs分离度

a）Rs=2（tR2-tR1）/（W2+W1）或

1.18（tR2-tR1）/（W2,h/2+W1,h/2）

b）Rs＜0.8不符合分析化学要求

Rs=1二峰重叠2%

Rs＞1.2二峰完全分离;2、K容量因子

a）K=（tR-tO）/to

b）K对分离度的影响

Rsαk/（K+1）;

常用溶剂的溶解度参数δ（25℃）

;对于大多数溶剂，极性参数（p）与溶解

度参数（δ）基本呈平行关系。

混合溶剂的溶剂强度按体积比取加权平

均值。

溶剂强度2个单位的变化一般可引起容量

因子10倍的变化。;3、N理论塔板数

a）N=16（tR/W）2或5.54（tR/Wh/2）2

b）N对分离度的影响

RsαN

c）提高柱效的方法

●增加柱长

●改进柱填料（纯度、物理性状）

●提高填装质量;4、α分离因子

a）α=K2/K1=t＇R2/t＇R1

b）α对分离度的影响

Rsα（α-1）/α

影响敏感，α的微小变化可显著改变Rs

c）改变α的方法

在保持流动相极性基本不变的前提下，

适当改变流动相的组成、组分的比例或添加

调节剂。;

;5、N与α对Rs贡献的比较

;二、VanDeemtor方程;1、柱效与流速的关系

存在最佳流速;2、柱效与填料粒径的关系

;;a）A=2λ·dp

式中2λ为与填充均匀性有关的因数

dp为填料的粒径

b）小的dp???利于传质

c）减小填料粒径可显著提高柱效;

;

;

由上表可见，减小dp可显著提高柱效→缩短

恒压

色谱柱→增加流速

↓↓

缩短洗脱时间;三、影响分离效果的其他因素;

;●粘度降低→柱压下降→可采用细粒径填料

（＜3um）或长色谱柱→提高柱效

●提高灵敏度色谱峰高与柱温呈指数函数关系，即峰高的对数与柱温呈线性关系

峰高随柱温呈指数增加时，灵敏度也呈

指数增加，数据表明，柱温从30℃上升至

90℃，定量限约可降低10倍。;

;●改善选择性不同溶质的保留时间随柱温变化的程度不尽相同，有可能使原来未分离的成分的得到基线分离，甚至发生洗脱顺序逆转。

这种温度使选择性改变的特性在混合物

的分离中非常有用，因为它只需简单地改变

柱温，而无需改变其他色谱条件。;

;;●温度匹配流动相须预热至柱温，温度匹

配可以使柱效提高50%以上。

柱后应配冷却单元，使洗脱液温度快速

降到一固定值（如35℃），以避免检测信号

的波动。;

;;

●色谱柱以硅胶为基质的填料，其使用温

度一般不超过60℃；HTLC使用以氧化锆、

多孔石墨碳、高分子微球为基质的填料或采

用多配位基有机硅胶为填料。;

2、pH引入次级化学平衡（电离、络合、

离子对等）改变溶质的浓度或存在形式，用

以提高选择性。;

;;3、柱外效应UPLC的技术要求

V池＜0.1V柱（2—5ul）

V管路＜0.1V柱（0.1mm,id）

V进样＜0.15V峰（2—5ul）

tC＜0.1tR（10—15S，自动进样器）

V死＜0.3ml;死体积的影响

●延迟出峰时间

●减低柱效

●使梯度曲线变形;四、UPLC（UFLC）的评估;2、短处：

●高柱压降（泵，摩擦生热导致柱效下降和选择性变化）

●色谱成分残留

●进样器交叉污染

●供试