免疫组化与杂交组化课件.ppt

免疫组化与杂交组化⒋抗体的种类⑴依来源分━①免疫抗体；②天然抗体；③自身抗体。⑵依反应分━①完全抗体；②不完全抗体。⑶依制剂或制备方法分——①多克隆抗体；②单克隆抗体；③基因工程抗体。免疫组化与杂交组化⒌抗体的制备⑴抗血清（多克隆抗体——针对同一抗原多个抗原决定簇的抗体）的制备流程①免疫原（抗原或抗原+佐剂）准备。包括抗原的抽提、纯化和剂量核算（1mg/ml）；佐剂乳化；半抗原的处理等。免疫组化与杂交组化*佐剂是一种非特异免疫增强剂，可增强免疫反应，提高抗体效价，常用福氏佐剂由85%石蜡油和15%羊毛脂组成（半佐剂），如加卡介苗(100ml佐剂中含卡介苗200mg）则为完全佐剂（FCA）。一般首次注射时用其1/2体积与等量抗原进行乳化。免疫组化与杂交组化第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上，如能长时间保持园珠形而不散开，表示乳化达到要求。免疫组化与杂交组化*半抗原的处理半抗原只有免疫反应性而无免疫原性，半抗原必须与大分子载体结合才能激发机体产生抗体，常用的载体有血兰蛋白、卵白蛋白、牛血清白蛋白等。两者交联的方法和原理是：免疫组化与杂交组化利用-NH2，-COOH等功能基团，用戊二醛或碳化二亚胺（R′-N=C=N=R″）作为交联剂可将半抗原结合到载体上，其结合比例为5KD结合5—25个分子的小肽，交联完成后，还必须纯化与载体结合的半抗原。免疫组化与杂交组化②动物的选择选择什么动物来免疫取决于所需抗血清的量，小白鼠只能提供1.0-1.5ml的血液，而山羊却能提供好几升；其次看你有多少抗原用于免疫动物，小白鼠不到50微克就足够，而山羊却要几毫克；免疫组化与杂交组化另外，还要考虑动物的品系，免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好，比如哺乳动物的比较保守的蛋白抗原可选择非哺乳动物（鸡）来制备抗体。常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔（新西兰兔，要求：年青，健壮，体重在2.5公斤左右，雄性）为最常用。免疫组化与杂交组化③免疫方法*途径：可以肌肉、静脉、皮内、皮下或腹腔注射，一般以皮内注射效果最好，多部位比单部位好，大动物一般不用腹腔注射，颗粒抗原和使用佐剂时不能I.V.。另外还可用淋巴结内注射来免疫，此法可大大减少抗原用量。免疫组化与杂交组化*次数及间隔时间：次数一般为2-3次，首次注射后，10-15天再加强注射，剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂；至于间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长，豚鼠、大鼠为7-8天；兔子为10-15天；羊为14-28天；有时第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。免疫组化与杂交组化由于各动物之间的个体差异颇大，故应多免疫几个动物从中选择效价高的。*效价测定：常用的方法有“琼脂免疫双扩散、免疫电泳、ELISA、免疫组化”等方法。免疫组化与杂交组化*放血或定期抽血：兔子和羊是从颈动脉插管来放血，豚鼠和大鼠则可从心脏穿刺抽血，小鼠可采取眼球摘除来采血，鸡往往从腋动脉取血。血液凝固后，及时离心收集血清。加叠氮钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如牛血清白蛋白、甘油等。免疫组化与杂交组化⑵单克隆抗体（针对单一抗原决定簇的抗体）的制备流程——一般分六个步骤：①免疫动物绝大多数McAb是用小鼠的免疫活性细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合而建立的杂交瘤细胞所产生的。一般用腹腔注射的途径来免疫雄性BALB/c小鼠。免疫组化与杂交组化可溶性蛋白抗原的剂量，最低每次1μg，常用10-20μg/次，抗原充足时，可用到每次50μg，但不要超过每次200μg，总量不超过500μg；如抗原为细胞，每次用量为106个细胞，一般注射2-3次，取尾静脉血测效价，用效价高的小鼠作细胞融合。免疫组化与杂交组化②细胞融合常用聚乙二醇（PEG）作融合剂，PEG分子量为1000-3000，常用1500，其浓度为50%（W/V），如用离心法融合，则用30%的PEG。融合时，骨髓榴细胞与小鼠脾细胞的比例在1：4-1：12之间，免疫后的小鼠脾赃约含5×107-2×108个淋巴细胞，每次融合需骨髓瘤细胞2×107，融合前培养细胞的密度2×105为宜。免疫组化与杂交组化③选择培养常用HAT（次黄嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶核苷）培养液来进行选择培养，其原理是HAT培养液抑制细胞正常途径的DNA合成，由于骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK），不能进行补救途径的DNA合成，在HAT培养液中正常途径DNA合成被抑制后就无法生存；免疫组化与杂交组化脾细胞虽含有这两种酶，在