基于全合成纳米抗体技术的黄曲霉毒素B1抗体制备及优化.pdf

摘要

摘要

真菌毒素是由不同真菌种类产生的次生代谢物，主要是曲霉、赤霉、镰刀菌和青

FAO25%

霉。据联合国粮食及农业组织()报道，世界上的食物受到真菌毒素污染。然

而，最近的一项研究表明，全世界60~80%的作物受到真菌毒素的感染，这一数字超

过了粮农组织给出的数字。曲霉属包括4个亚属339种。曲霉产生的真菌毒素被称为

黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是由各种类型的曲霉，特别是黄曲霉和寄生曲霉产生的次生

代谢物，具有较强致癌作用。目前已经分离鉴定出来的黄曲霉毒素及其衍生物有20

多种，其中黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1，AFB1)的毒性作用最强，被世界卫生组织的

国际癌症研究机构(ARC)划分为类致癌物质。为了避免ⅠAFB1的污染风险，几乎世

界上所有的国家和地区都制定了AFB1的强制限量标准。

为了避免受到黄曲霉毒素B1的污染，检测所有食物中AFB1的含量显得特别重

要。当前有很多检测技术可应用于检测AFB1，主要包括理化分析方法和免疫学方法

等。其中，免疫学方法由于其精确度高，特异性强，操作简便等优点被广泛地用来检

测AFB1，但它需要高灵敏度和特异性的抗体。随着分子生命工程的持续发展，重组

抗体特别是单链抗体(SinglechainFvantibodyfragment,ScFv)由于其易于改造、批次

间差异小、制备时间短和表达量高等优点成为研究板块。但是，单链抗体与其亲本单

克隆抗体相比，亲和力较低此外稳定性较差，从而导致在应用上具有局限性。研究抗

原抗体间的不同反应，阐明单链抗体亲和力的影响机制，可为在基因水平上改造单链

抗体，进一步提高其亲和力提供理论指导。本研究通过全合成噬菌体展示库筛选制备

黄曲霉毒素B的纳米抗体，进一步结合计算机辅助建模设计实现抗体优化，主要内

1

容及实验结果如下：

(1)基于噬菌体展示技术利用实验室前期建成的全合成抗体库筛选制备黄曲霉毒

素B1抗体基因G5，在此基础上对其进行表达，以期获得大量与AFB1结合的单链抗

体，随后通过创建表达载体，再将修饰表达载体转化至感受态细胞BL21(DE3)中，

进行诱导后获得可翻译的蛋白即纳米抗体，用于生物活性的鉴定实验。ELISA检测分

析G5对AFB1-BSA的结合率以及AFB1对G5结合的抑制率，综合分析抗体亲和力。

G5AFB1-BSAEC0.95μmol/LAFB1AFB1-

结果表明，对的50约为与抗体竞争结合

BSA的IC约为43μmol/L，亲和力较好。

50

III

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(2)考虑到G5可能存在亲和力不高、特异性不强的问题，提出了一种基于计算机

引导的同源建模和分子对接的体外亲和力成熟方法来优化抗体，通过计算机辅助搜寻

目标序列同源建模模板、再进行目标序列与同源模板的多重序列比对，同时对同源模

型的构建和模型评估、优化，最终获得一个可靠的三维结构。从抗体-抗原复合结构

G5AFB1

上来看，根据该试验构建模型与的分子对接，进行相互作用力分析。对接

结果按照复合物能量值排序，能量越低表明该结构越稳定。通过打分，最佳G5-AFB1

复合物能量分值为-6.29kcal/mol。G5-AFB1复合物结构选择单链抗体的互补决定区

(ComplementarityDeterminingRegions,CDRs)AFB1

区进行分析，与纳米抗体结合的氨

基酸残基位点为：TYR103、VAL102、ARG101、ILE51、THR52、THR58，并且AFB1