软枣猕猴桃品种鉴别技术规程SSR分子标记法.docx

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DB××/T××××—2021

软枣猕猴桃品种鉴别技术规程SSR分子标记法

1范围

本文件规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子标记法对软枣猕猴桃（Actinidiaarguta(Sieb.Zucc)Planch.exMiq.）材料进行鉴别过程中样品准备、DNA提取、PCR扩增、PCR扩增产物检测、指纹比对、数据记录、结果判定等方面的技术要求。

本文件适用于SSR分子标记技术构建软枣猕猴桃资源DNA指纹图谱过程中DNA分子数据采集和鉴别。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则

LY/T2745仁用杏品种鉴定技术规程SSR分子标记法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

PCR

指聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR)，是利用一段DNA为模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同参与下，将该段DNA扩增至足够数量，以便进行检测分析。

3.2

SSR分子标记SSRmolecularmarker

又称微卫星标记，由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守的单拷贝序列，因而可根据两端的序列设计特异性引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA重复序列进行扩增，通过电泳可以区分不同大小的扩增产物片段，经荧光染料标记加以区分。

3.3

待检样品testsample

待鉴别的软枣猕猴桃样品，由送检人提供。

3.4

对照样品controlsample

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用于与待检样品进行指纹比对的样品，由送检人提供。

3.5

核心引物coreprimer

扩增产物具有高度的稳定性和一致性（无干扰谱带），并具有较强的鉴别能力，可以用于建立软枣猕猴桃比对的人工合成引物。

3.6

SSR指纹图谱SSRfingerprint

采用SSR核心引物（或相当于核心引物）扩增出的待检样品和对照样品的DNA片段，通过毛细管电泳，得到不同大小的DNA片段图谱。

3.7

指纹对比fingerprintcomparison

将待检样品与对照样品的SSR指纹图谱进行比对，分析待检样品与对照样品的SSR指纹是否具有差异，并确定其大小。

4测试准备

4.1仪器设备与主要试剂、耗材

仪器设备与主要试剂、耗材参见附录A。

4.2溶液配制

溶液配制方法参见附录B。

4.3核心引物

核心引物信息参见附录C。

4.4样品准备

依据NY/T2324中样本采集的技术规定进行样本采集，3次以上重复。取无病虫害的健康的芽，做好标记后，蒸馏水清洗后-80℃保存。

5DNA提取

a）将样品倒入研钵中，加入液氮研磨2次，约取0.1mL放入1.5mL离心管；

b）加入900μL2.5%CTAB提取液，65℃水浴60min，每10min颠倒，混匀；

c）10000r?min-1离心1min，取上清650μL，加650μL氯仿∶异戊醇（24:1）混合液，混匀；d）10000r?min-1离心5min，取上清400μL，加入800μL无水乙醇，-20℃放置30min；

e）5000r?min-1离心1min后倒掉上清液，用70%乙醇洗3次，自然风干，再用50μLTE溶解，置于4℃备用或保存；

f）用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA提取质量，要求电泳条带清晰明亮；

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g）用紫外分光光度法测定纯度和浓度，OD260/OD280比值范围在1.7~1.9之间即为可用DNA样品，将其最终质量浓度调至20ng?μL-1。

6PCR扩增

6.1PCR反应体系

总体积为20μL，其中6.0μLddH2O，10μL2×Taqmastermix，2.0μLDNA模板（20ng?μL-1），1.0μLF-primer（20μmol?L-1，5’端饰有FAM荧光标记），1.0μLR-primer（20μmol?L-1）。

6.2PCR扩增程序

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃10min，4℃保存。

7PCR扩增产物检测

7.1标样准备

取PCR产物0.3μL、LI