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BDAccuriC6Plus基础操作流程

BDAccuriC6Plus光路信息:

（滤光片可根据需求更换，下表为常用配置）

激发器

检测器

滤光片

检测荧光

488nm

FL1

533/30

FITC、GFP、Alexa488

FL2

585/40

PE、PI

FL3

670LP

PI、PerCP、PerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy7

640nm

FL4

675/25

APC、PE-Cy5、Alexa647

开机

2.1检查所有瓶中的液体，鞘液桶补满鞘液（2L），废液桶倒空，清洗液和消毒液各250mL

清洗液：1%BDFACSCleaningsolution

消毒液：BDdetergentsolutionconcentrate(3mlBDdetergentsolution+197mlddH2O)

上样管装2mLddH2O，套于上样针下，轻轻拉出样品支架托住上样管。本仪器采用的是蠕动泵负压液流系统，上样管可以不用封闭，因此可以使用多种EP管和流式管作为上样管；

按下仪器前方电源键，双击打开电脑上CFlow软件，软件的工作面板（workspace）分布如下图，或者在File下点击NewWorkspace打开新的workspace：

仪器启动期间，软件界面上仪器当前状态会显示黄色的灯，该过程中仪器会用鞘液冲洗液流管路，持续大约13分钟，直到显示绿灯；

当仪器状态显示绿灯时，表示仪器和软件连接完成。

质控

3.1点击面板上的”InstrumentQC”,进入质控界面；

500ulddH2O+1滴BDCSTRUOBead（#661414、661415），混匀

BDCSTBeadLot选择CST小球的批号（注意不是货号），如没有则在Install下倒入对应的批号文件；

点击RUN开始获取数据；

结束后取下质控小球，放上一管ddH2O；

分析质控数据，Noise数据不要分析，直接看BDCSTBeads;

在FSC和SSC中圈中Dim和Mid+Bright两圈小球；

；

后面几个荧光通道的图中圈中最亮的那群小球，不要圈到其它信号；

质控报告显示本次质控是否通过；

3.9点击History:Levey-Jennings查看质控历史。

4．上样

4.1新建一个Workspace，点一个空白样本孔，用ddH2O运行2分钟；

4.2上样品，设置收集的限制条件，样品流速（建议设置条件的时候选择慢速上样）和阈值，系统默认的阈值是FSC-H80000，注意未达到阈值的信号都不会被记录和保存，可以点击setthreshold自己设置阈值；

4.3画图（散点图、密度图和直方图），设门，命名坐标轴；

4.4点击流式图中的GATE可以打开套嵌门设置面板，根据实验要求，选择include、exclude或者多个门的交集intersection，选择门是来自于是在上一级门中还是来自于第一级所有的events（onallevents）；

4.4每个样品之间，用ddH2O运行10s以免数据交叉污染（根据实际情况自行调整）。

5.调节补偿

5.1如果用多荧光标记，为了避免荧光信号漏到其它检测通道，需进行补偿调节，C6的补偿调节可以在数据收集完毕后脱机进行；

5.2收集完阴性和单阳样本后（也可以等所有样本都收集完毕），利用阴性样本画出十字门，然后点击一个单阳的样本孔，点击面板上的SetColorCompensation，打开补偿调节面板；

5.3例如用FL2通道的荧光素调节FL1的补偿，则如图所示在FL1中减去X%FL2，最后使FL1完全为阴性，且FL2阳性群的中心与阴性群的中心平行（横平竖直），其它通道同理，点击apply预览，可以继续调节，点击Applytoallsamples将补偿值应用到所有样本。

5.4如果做四色的补偿，例如FITC/PE/PerCP/APC四个荧光染料，如下作图：

四个通道都需两两调节补偿。用FITC单阳管调节PE/PerCP/APC的补偿，即分别用PE/PerCP/APC-X%FITC；用PE单阳管调节FITC/PerCP/APC的补偿，即分别用FITC/PerCP/APC-X%PE；PerCP和APC以此类推。简单记忆：上哪根单阳管，就用其他通道减去该单阳管的荧光，上谁减谁。

6．数据分析

6.1数据收集完毕后，可打开Analyze、Statistics或BatchAnalysis分析；

6.2Analyze中，可以用相同的Plots和Gates分析多个样本的数据，也可以以任意组合方式查看几个plots和样本数据，还能生成不同颜色叠加的直方图；

6.3Statistics中将来自多个样本的