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全长人源抗VEGF抗体库的构建及展示

肾癌是泌尿系统威胁人类健康的常见恶性肿瘤,对放疗、化疗均不敏感。由

于肾癌起病隐匿,在诊断时有25～30%已发生转移。

而且,即使是局限性肾癌,采取根治术后仍有近30%患者会复发。针对这部分

转移及复发肾癌的治疗是泌尿外科的难点和研究方向。

随着研究深入,发现肾癌特别是透明细胞癌多存在VonHippel-Lindau(VHL)

基因突变,乏氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor,HIF)及血管内皮生长因子

(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表达增高,而且VEGF增高与肿瘤

分期及预后密切相关。因此,抑制或阻断VHL-HIF-VEGF信号通路,特别是阻断

VEGF或其受体VEGFR,就可能抑制肾癌的生长。

贝伐单抗(Bevacizumab)是VEGF特异性的经过人源化改造的鼠源抗体,能特

异性与VEGF结合并阻断其生物活性。贝伐单抗联合IFN-α可以提高转移性肾癌

的客观缓解率(ORR)和无疾病进展率(PFS)。

2007年12月美国FDA批准贝伐单抗联合IFN-α作为靶向治疗转移性肾癌的

一线治疗方案。然而,通过杂交瘤技术获得的单抗需经过人源化改造,一方面不可

能完全去除抗体的免疫原性,另一方面抗体空间构型可能发生改变,亲和力往往

会降低,很难达到预期的作用效果。

为了尽可能减少药用抗体的免疫原性,研究者尝试利用哺乳动物细胞表面抗

体展示技术用于人源抗体的筛选,但目前的这些哺乳动物细胞表面展示技术所构

建抗体库容量多局限于104～106,筛选抗体多样性不足,不能满足筛选高亲和力

抗体的要求。为了克服哺乳动物细胞表面展示技术筛选全长人源抗体存在的上述

不足,本课题组对现有的哺乳动物细胞展示技术作了技术改良。

人的VEGF是一种自身蛋白,以来自于自身免疫病患者的外周血淋巴细胞为

材料构建抗体库筛选到抗VEGF抗体的几率更大。通过提取自身免疫病患者的外

周血淋巴细胞的总RNA,进行RT-PCR扩增全套抗体基因,随后使用哺乳动物细胞

表达载体pDGB-HC-TM,构建了三个全长人源抗体基因库,库容量达到1010以上。

将抗体基因库通过四片段连接插入哺乳动物细胞表达载体pDGB4,然后将其

稳定转染FCHO细胞。由于采用基因定点整合技术,每个细胞只表达一种抗体,从

而成功建成能展示全长抗体的哺乳动物细胞库。

本课题通过全基因合成的方法合成了贝伐单抗的全长基因,并根据哺乳动物

细胞对密码子的选择性对抗体基因的碱基序列进行表达优化,既作为筛选抗体的

阳性对照,同时也用于抗体的链置换筛选技术,以提高筛选VEGF特异性抗体的成

功率；与已经构建好的三个抗体库基因进行链置换,构建了全长人源抗VEGF抗体

库,并成功将其展示于哺乳动物细胞表面。一、全长人源初级抗体库的构建及展

示目的：构建大容量的全长人源初级抗体基因库。

方法：1.外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取从供体中采集适量静脉血,

置于肝素抗凝管中,采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞,加入适量Buffer

RLT,裂解细胞,—80℃冰箱保存备用或者直接用于提取总RNA。2.cDNA第一链的

合成以总RNA为模板,应用根据V-BASE网站信息所设计合成的全套人抗体重链可

变区引物和全套人抗体轻链恒定区引物,逆转录合成cDNA第一条链。

3.全套IgG1重链可变区基因和轻链K型全长基因的扩增以合成的cDNA为模

板,用相应的特异性引物扩增全套IgG1轻链K型全长基因及全套IgG1重链可变

区基因(3套轻链引物,3套重链引物)。PCR条件为：94-C预变性5分钟,然后进

行35个循环的PCR扩增(94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min),随后在延

长温度下反应7min,以确保全长目的片段的合成。

PCR扩增产物的分离纯化用PCR扩增抗体全套Kappa轻链和重链可变区基因。

PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。

然后将回收得到的3组重链基因PCR扩增产物,再次经1%琼脂糖凝胶电泳后

回收目的片段备用。并用同样方法处理3组轻链PCR扩增产物。

重链抗体基因库及轻链基因库的构建及鉴定以BsmBI对重链基因扩增产物

及载体