细胞凋亡及其调控分子机制.ppt

第95页,共117页，星期六，2024年，5月三、流式细胞仪检测flowcytometer（一）PI单染（二）Hoechst33342/PI双染色（三）Annexinⅴ/PI双染色第96页,共117页，星期六，2024年，5月流式细胞仪flowcytometer

荧光激活细胞分类器fluorescentactivatedcellsorter,FACS

?Hoechst33342是双苯并咪唑家族成员，能特异性与DNA螺旋小沟中AT结合。它能被活细胞摄入，也能在摄入后被细胞排出。活细胞对碘化丙锭（PI），溴化乙锭（EB）有拒染性，当细胞被这些染料着染，提示为晚期凋亡或坏死。第97页,共117页，星期六，2024年，5月（一）PI单染

细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中，但是细胞膜完整，不能离开细胞。乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。坏死细胞中，DNA可染性并不立即下降，甚至反而增加，可能是由于细胞坏死时部分DNA变性，引起更多的可染位点。原理：第98页,共117页，星期六，2024年，5月收集细胞，PBS洗涤冷70％乙醇固定12h以上离心，PBS洗涤，400目筛网过滤PI（含RNase）染色流式细胞仪检测?操作：第99页,共117页，星期六，2024年，5月判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。（检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死）AB第100页,共117页，星期六，2024年，5月PI单染检测细胞周期改变

细胞周期分析第101页,共117页，星期六，2024年，5月（二）Hoechst33342/PI双染色染料配制：Hoechst33342：配10ug/ml,4℃避光保存。PI：5ug/ml,4℃避光保存。第102页,共117页，星期六，2024年，5月原理：凋亡细胞膜在早期是完整的，但细胞膜的通透性已有增加，因此进入早期凋亡细胞的Hoechst比正常细胞多；而EB、PI等不能进入凋亡细胞。即正常细胞不经固定，对EB、PI是拒染的。而坏死细胞早期就被破坏，能被这些染料染色。第103页,共117页，星期六，2024年，5月操作：悬浮细胞＋Hoechst33342，终浓度1ug/ml,贴壁细胞消化后，培养液重悬，加Hoechst，37℃,7-10min，离心，洗涤，加PI，4℃避光15min，400目滤网过滤，流式细胞仪检测。第104页,共117页，星期六，2024年，5月结果判断：在双变量流式细胞仪散点图上正常细胞Hoechst(-),PI(-)凋亡细胞Hoechst(+),PI(-)坏死细胞Hoechst(+),PI(+)?第105页,共117页，星期六，2024年，5月第106页,共117页，星期六，2024年，5月（三）Annexinⅴ/PI双染色原理：磷脂酰丝氨酸（PS）主要存在于细胞膜内侧，细胞凋亡时，它移向细胞外侧。可能是PS膜内外转位酶的早期激活有关。Annexinⅴ是一种Ca2＋依赖磷脂结合蛋白，对PS有高度亲和性。PS外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死细胞膜完整性受到破坏,可用PI区分。第107页,共117页，星期六，2024年，5月消化收集细胞，1000rpm离心6min，弃上清。加入1mL冷的PBS，轻轻振荡使细胞悬浮，离心，弃上清。加入1mL冷的1×bindingbuffer，轻轻振荡使细胞悬浮，离心，弃上清。4.将细胞重悬于200μL1×bindingbuffer。5.加入10μLAnnexinⅴ-FITC和5μL碘化丙锭（PI），轻轻混匀，室温避光反应15min。加入300μL1×bindingbuffer，立即上机检测。6.流式细胞仪CellQuest软件分析细胞凋亡和坏死的百分率。每个样本随机分析10000个细胞。操作：第108页,共117页，星期六，2024年，5月检测标准：