朱鹮大肠埃希菌PCR检测技术规程.docx

ICS07.100

CCSB05

DJG330521

德清县地方技术性规范

DJG330521/T111—2024

朱鹮大肠埃希菌PCR检测技术规程

CodeofpracticeforPCRdetectionofEscherichiacoliisolationfromcrestedibis

I2024-11-01发布2024-12-01

I

德清县市场监督管理局发布

DJG330521/T111—2024

I

目次

前言 Ⅱ

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4缩略语 1

5试剂、材料及设备 1

6PCR鉴定 2

7废弃物无害化处理和人员安全防护 2

附录A（资料性）培养基制备 4

附录B（资料性）试剂制备 5

附录C（资料性）参考序列 6

参考文献 7

DJG330502/T111—2024

II

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由德清县自然资源和规划局提出并归口。

本文件起草单位：德清县生态林业综合服务中心（德清县湿地和野生动植物保护管理站）、浙江农林大学、湖州市生态林业保护研究中心。

本文件主要起草人：邱国强、杨永春、石坚、白洪青、费群伟、李颖、宋厚辉、朱炜、高洪娣、李元春、陈严雪、段润、吴丞昊、牛冬、马翔、徐新泉、陈亦洁、陈梦娇、吴燕芬、陆行舟、刘寒、陆璐彬、耿学进、陈儒欣、俞越。

DJG330521/T111—2024

1

朱鹮大肠埃希菌PCR检测技术规程

1范围

本文件规定了朱鹮大肠埃希菌（Escherichiacoli）的PCR检测方法。

本文件适用于朱鹮泄殖腔拭子、粪便、感染组织等样本中大肠埃希菌的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范

SN/T2984检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

大肠埃希菌Escherichiacoli

革兰氏阴性菌，短杆状，周身鞭毛，无芽孢，无荚膜，能运动，兼性厌氧，大多能分解乳糖。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PCR:聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）DNA:脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

5试剂、材料及设备

5.1试剂及耗材

灭菌蒸馏水（应符合GB/T6682中一级水规格）、蒸馏水、缓冲葡萄糖黄绿胆盐肉汤（EE肉汤,

制备见附录A）、50×TAE电泳缓冲液（见附录B）、1×TAE电泳缓冲液、2×KODDyeMix、DNAMarker、琼脂糖、10000×GelRed核酸染色剂、Tris、Na2EDTA·2H2O、醋酸、1.5mL离心管、PCR反应管、细菌基因组DNA提取试剂盒。

5.2设备

DJG330502/T111—2024

2

可调移液器（0.1μL-2.5μL、1μL-10μL、10μL-100μL、100μL-1000μL）、恒温培养箱（37℃)、PCR扩增仪、凝胶电泳仪（150V）、凝胶成像仪、超净操作台、酒精灯、高速离心机（离心力12000g）、电子天平（量程0g-500g，感量0.1g）、冰箱（4℃、-20℃)、高压灭菌锅（121℃)、无菌试管（18mm×180mm）、精密pH试纸。

5.3引物

针对大肠杆菌16SrRNA基因，采用大肠杆菌鉴定引物（ECO_F和ECO_R）扩增585bp的种特异性片段，引物序列分别为：

ECO_F：5’-GACCTCGGTTTAGTTCACAGA-3’ECO_R：5’-CACACGCTGACGCTGACCA-3’

6PCR鉴定

6.1样本处理

组织样本用接种环挑取少许，接种于10mLEE肉汤中，于37℃温度条件下150rpm振荡培