8第八章 蛋白质和氨基酸的测定.ppt

3.自动凯氏定氮法（1）原理、仪器自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置、自动吸收和滴定装置及自动数字显示装置。消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外线加热装置组合而成的消化炉。（2）试剂除硫酸铜与硫酸钾制成片剂外，其它试剂与常量凯氏定氮法相同。第三节蛋白质定量测定——（1）凯氏定氮法3.自动凯氏定氮法（3）操作方法称取0.50~1.00g样品，置于消化瓶内，加入硫酸铜与硫酸钾片剂两片，加入浓硫酸10m1，将消化瓶置于红外线消化炉中，用连接管连接密封住消化瓶，开启抽气装置，开启消化炉电源，30分钟后8个样品消化完毕，消化液完全澄清并呈绿色。取出消化瓶，移装于自动凯氏定氮仪中，接连开启加水的电钮、加碱电钮、自动蒸馏滴定电钮，开启电源，大约经12分钟后由数显装置即可给出样品总氮百分含量，并记录样品总氮百分比。根据样品的种类选择相应的蛋白质换算系数F，即可得出样品中蛋白质含量。开启排废液电钮及加水电钮，排出废液并对消化瓶清洗一次。第三节蛋白质定量测定——（1）凯氏定氮法第三节蛋白质定量测定——（1）凯氏定氮法第三节蛋白质定量测定——（1）凯氏定氮法第三节蛋白质定量测定——（1）凯氏定氮法第三节蛋白质定量测定——（2）双缩脲法原理在碱性条件下，Cu2+和多肽(至少有两个肽键，如双缩脲、多肽和所有蛋白质)生成的复合物呈紫红色，吸收波长为560nm，比色法测得的吸光度值(OD值)与样品中的蛋白含量成正比。以酪蛋白为标准样品，制作标准曲线，从而求出样品蛋白质含量。第三节蛋白质定量测定——（2）双缩脲法试剂酪蛋白标准溶液：用0.05mol/LNaOH溶液配制5mg/mL的酪蛋白标准液。双缩尿试剂：称取1.50gCuSO4和6.0g酒石酸钾钠，溶于500mL水中，在搅拌下加入10%NaOH溶液300mL，最后用水稀释至1000mL，储存在内壁涂有石蜡的瓶中，可长期保存。测定吸取1mL样品溶液→用水补足2mL→加入4mL双缩脲试剂→在15-250C方30min→以介质溶液(水)调零→测定A540nm→查工作曲线或代入线性拟合方程→得出蛋白质含量。第三节蛋白质定量测定——（2）双缩脲法说明及注意事项测定可溶性蛋白，速度快，但灵敏度低。蛋白质种类不同对发色程度的影响不大。含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去。样品中有不溶性成分存在时，给比色测定带来困难，可预先将蛋白质抽提出再进行测定。当肽链中含有脯氨酸时，若有大量糖类共存，则显色不好，会使测定值偏低。该法已被用于谷物、肉类、大豆及动物饲料的蛋白质定性测定[AOCO方法935.11]。第三节蛋白质定量测定——（3）福林-酚比色法原理蛋白质与福林-酚试剂反应，产生蓝色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键产生双缩脲反应，同时蛋白中存在的酪氨酸与色氨酸同试剂中的磷钼酸-磷钨酸反应产生颜色。呈色强度与蛋白质含量呈正比，使检测可溶性蛋白含量的最灵敏的经典方法之一。说明：此法灵敏度高，酚类及柠檬酸对本法有干扰第三节蛋白质定量测定——（4）考马斯亮蓝法原理考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德华力结合，使蛋白质染色，在620nm出呈现最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。试剂牛血清蛋白标准液：称取牛血清蛋白10mg，用蒸馏水配成100?g/mL标准溶液。染料试剂：称取考马斯亮蓝G25060mg，溶于100mL3%过氯酸溶液中，滤去为溶解的染料，储存于棕色瓶中备用。第三节蛋白质定量测定——（4）考马斯亮蓝法测定吸取样品溶液2mL→架染料试剂2mL→混匀→以介质溶液调零→测定A620nm→查标准曲线，求出蛋白质含量。说明及适用范围本法适用于牛乳、冰淇淋、巧克力饮料、脱脂乳粉等食品。本法快速、简单，适合大量样品测定，灵敏度与福林-酚法相近，但不受酚类、游离氨基酸和小分子肽的影响。第三节蛋白质定量测定——（5）紫外吸收法第三节蛋白质定量测定——（5）紫外吸收法(1)280nm紫外吸收法原理由于蛋白质中存在含有共轭双键的的酪氨酸和色氨酸，因此具有紫外吸收性质，在280nm处，蛋白质溶液的光吸收值与其浓度成正比，可定量测定。第三节蛋白质定量测定——（5）紫外吸收法试剂标准蛋白质溶液(两种，任选其一即可)牛血清蛋白标准液：称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，用水配成1mg/mL的蛋白质溶液。卵清蛋白标准液：称取经凯氏定氮法校正的卵清蛋白，用0.9%NaCl配成1mg/mL的蛋白质溶液。测定吸取1mL样品溶液→加蒸馏水至4mL→以蒸馏水调零→测280nm处的吸光值A→查标准曲线→得样品蛋白质含量。说明本法测定与标准蛋