生化试验设计 PPT.pptVIP

生化设计实验设计实验人员：赵乐，王康华，王凯，孔景浩,许瑶，王轩，王硕大家好*最熟悉而又最陌生血红蛋白的分离、纯化，鉴定和定量大家好*试验报告单实验目的实验原理实验试剂实验步骤实验结果临床意义大家好*实验目的1，掌握自主设计实验的步骤与方法；2,血红蛋白的分离、纯化、鉴定和定量的方法；3,熟悉血红蛋白分离提纯的原理。大家好*实验原理——血红蛋白概况血红蛋白是红细胞的主要成分，在正常情况下，每个红细胞均含有一定量的血红蛋白。血红蛋白是由珠蛋白和亚铁血红素组成的结合蛋白质。血红蛋白除能与氧结合形成氧合血红蛋白外，还能与某些物质作用形成多种血红蛋白衍生物。它们具有特定的色泽和吸光谱，在临床上，可用以诊断某些变性血红蛋白血症和血红蛋白的定量测定。大家好*实验原理——基本原理根据蛋白质各种特性的差异，如蛋白质的理化性质、形状、大小、电荷性质和多少、吸附性质、亲和力、溶解度等等，可以用来分离不同种类的蛋白质大家好*试验原理不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不一样，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不一样。凝胶电泳法原理凝胶色谱法原理透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留袋内，以达到清除小分子杂质的目的。透析法原理当不同蛋白质通过凝胶时相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶的内部通道，而相对分子质量较大的蛋白质无法进入内部通道只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。标准比色法原理在一定量的血液中，血红蛋白经少量的盐酸的作用，使亚铁血红素变成高铁血红素。呈现较稳定的棕色，用水稀释后与标准色比较，即可得出每100ml血液中的含量大家好*实验试剂1、0.9%的氯化钠溶液2、蒸馏水3、有机溶剂（甲苯）4、磷酸缓冲液5、柠檬酸钠6、凝胶色谱柱实验所需用品7、SDS实验所需用品8、血红蛋白计、0.1mol/L盐酸溶液、载玻片、刺血针大家好*实验步骤——样品处理a、洗涤红细胞：在采血容器中加入适量柠檬酸钠，取血后，进行低速短时间离心，将离心后的血液静置片刻，待分层明显后，用胶头吸管吸出上层黄色透明血浆，然后用五倍体积的质量分数为0.9%的氯化钠溶液洗涤，低速短时间离心，重复4-5次，直至上清液中没有黄色，表明已洗净。大家好*实验步骤——样品处理b、血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟。大家好*实验步骤——样品处理c、离心：将搅拌好的混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10分钟，试管中的溶液会分为四层：最上层为无色透明的甲苯层；中上层为白色薄层固体的脂溶性物质的沉淀层；中下层为红色透明的血红蛋白的水溶液层；最下层为暗红色其他杂质的沉淀层。大家好*实验步骤——样品处理d、分离血红蛋白溶液：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，在分液漏斗中静置片刻后，分离出下层红色透明液体。大家好*粗分离取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，pH为7.0，透析12小时，目的是除去样品中分子量较小的杂质或用于更换样品中的缓冲液。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。大家好*纯化a、凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。（注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。）④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。大家好*b、凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。大家好*c、样品加入与洗脱：①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时