第5章-分子生物学技术-上.ppt

第五章分子生物学研究法基因工程中常见的名词：遗传工程--geneticengineering；基因操作--gonemanipulation；基因克隆--gonecloning；分子克隆--molecularcloning；重组DNA技术--recombinantDNAtechnology。第一节基因操作的主要技术原理基因工程的主要内容或步骤:

1.从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。

2.将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。

3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。DNA重组技术DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体DNA重组操作过程示意图3.细菌的转化???所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。λ噬菌体作为

克隆载体聚合酶链式反应示意图第二节PCR技术故事发生在1983年

的春夏之交很少有在公司工作的科研人员得

诺贝尔奖，Mullis是其中之一KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...Mullis的第一个PCR实验1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。PCR的发展史1983年春，Mullis发展出PCR的概念；1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49bp长度的第一个PCR片断；1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），这回Mullis是第一发明人。1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，TaqDNApolymerase，这是85年春天Mullis建议做的；1988年，第一台PCR仪问世；1991年，HoffmanLaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。PCR不只是一个方法改进Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。**第一节基因操作的主要技术原理第二节PCR技术第三节实时定量PCR技术第四节基因文库构建第五节RACE技术第六节酵母双杂交技术第一节基因操作的主要技术原理基因工程的主要内容或步骤:

4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。

5.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。第一节基因操作的主要技术原理PvuⅡ第一节基因操作的主要技术原理第一节基因操作的