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海胆主要疾病诊断与防治技术规程

1范围

本文件规定了中间球海胆红斑病和黑嘴病的临床症状、病原鉴定方法与结果判定和防治技术规程。

本文件适用于由溶珊瑚弧菌（Vibriocoralliilyticus）、锡那罗州弧菌（Vibriosinaloensis）、灿烂弧菌（Vibriosplendidus）、棘皮动物弧菌（Vibrioechinoideorum）、嗜环弧菌（Vibriocyclitrophicus）感染导致的中间球海胆（Strongylocentrotusintermedius）红斑病和黑嘴病的诊断和防治。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB11607渔业水质标准

SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范

GB/T4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB/T4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验

GB/T4789.5食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验DB50/T1606水生动物细菌性病原鉴定技术规范

SC1059渔用含氯消毒剂

DB21/T1859农产品质量安全光棘球海胆增养殖技术规范NY5071无公害食品渔用药物使用准则

SC/T1132鱼药使用规范

中华人民共和国农业农村部第250号公告中华人民共和国农业农村部第2292号公告中华人民共和国农业农村部第2583号公告中华人民共和国农业农村部第2638号公告

3诊断

3.1现场调查

水质情况包括水源、水色、水温、透明度、pH、亚硝酸盐、氨氮、溶解氧、硬度等；养殖情况包括养殖密度、苗种来源、饵料来源等。

3.2临床诊断

3.2.1海胆红斑病

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患红斑病海胆表现为体表出现大小不等的暗红色粘性斑块，严重者斑块处破溃，体腔内液从破口流出。

3.2.2海胆黑嘴病

患黑嘴病海胆表现为摄食能力下降，附着能力减弱，棘刺脱落，围口膜颜色发黑。

3.3病原检测

3.3.1试剂材料

检验中所需试剂、染色剂、培养基的配制按照GB/T4789.28、GB/T4789.4和GB/T4789.5规定执行，双蒸水、10×PCR缓冲液、dNTP、TaqDNA聚合酶、琼脂糖、核酸染料、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒选用专业试剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录A。

3.3.2仪器设备

超净工作台、生物安全柜、医用冰箱、高速离心机（100rpm～20000rpm）、高压灭菌锅、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、生化培养箱、移液器等。

3.3.3采样

按照严格要求进行现场采样，样品采集符合SC/T7103要求。

3.3.4细菌分离与纯化

在超净工作台或生物安全柜中，用灭菌接种环蘸取海胆病灶部位（红斑病病灶多位于体表，黑嘴病病灶多位于围口膜），常规划线接种至2216E培养基。将划线好的平板倒置在培养箱中，20℃±2℃培养24h～48h。观察菌落生长情况，从中挑取优势单菌落，在超净工作台或生物安全柜中用无菌接种环挑取单菌落于2216E培养基中，放置在培养箱中培养24h～48h。观察菌液状态，若浑浊，则于4℃保存待检。

3.3.5细菌理化指标测定

3.3.5.1革兰氏染色

按GB/T4789.28的规定执行。

3.3.5.2生理生化试验

3.3.5.2.1赖氨酸脱羧酶试验

按GB4789.5中的规定执行。

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3.3.5.2.2鸟氨酸脱羧酶试验

按GB4789.5中的规定执行。3.3.5.2.3精氨酸脱羧酶实验

按GB4789.28中的规定执行。3.3.5.2.4蔗糖水解试验

按GB4789.28中的规定执行。3.3.5.2.5蛋白胨水试验

按GB4789.4中的规定执行。3.3.5.2.6甘露醇利用试验

按GB4789.28中的规定执行。

3.3.6细菌分子生物学鉴定

3.3.6.1细菌DNA抽提

取2mL待检菌培养液，12000r/min离心1min，收集菌体。菌体悬浮于500μLTE缓冲液（pH8.0），震荡悬浮，加入50μL10%的SDS溶液，10μL20mg/mL的蛋白酶K，混匀，37℃温育1h。加入100μL5mol/L的NaCl