载体与目的基因的连接与转化以及重组DNA的提取与酶切鉴定 .pdfVIP

实验一载体与目的基因的连接与转化以及

重组DNA的提取与酶切鉴定

一、实验目的

1.CaCl法制备感受态细胞

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2.目的基因与载体连接（c-myc+pSV2；粘端连接）

3.重组质粒转化大肠杆菌并筛选转化体（HB101；Ampr）

4.质粒DNA的小量快速制备

5.质粒DNA的限制性内切酶酶切

6.DNA的琼脂糖凝胶电泳

二、实验原理

通过粘端连接法将具有相同粘性末端的DNA分子连接在一起，通过碱基配

对氢键形成一个相对稳定的结构，利用连接酶发挥间断修复的功能，从而获得重

组的DNA分子。

受体细胞经处理后（电击或CaCl等处理），细胞膜通透性发生变化，从而使

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外源的载体分子通过感受态细胞，并使受体细胞获得新的稳定遗传的性状，该过

程称为转化。由于本实验种pSV带有抗氨苄青霉素的基因，因而转化后的细胞

在含氨苄青霉素的平板上培养可以筛选出转化成功的受体细胞。

分离质粒DNA的步骤包括：培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌以及分

离和纯化质粒DNA。SDS可以使细胞壁裂解，碱变性抽提质粒DNA的原理是

利用染色体DNA与质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的，当pH＞12.6时，

染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA由于超螺旋共价闭

合环状结构，两条互补链不会完全分离。当采用pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节

pH至中性时，质粒DNA恢复原有的构型，而染色体DNA则不能复性而缠绕形

成网状结构。通过离心可将染色体DNA及大分子RNA、蛋白质等去除。

三、实验器材和试剂

１.器材

恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴、台式离心机、低温离心机、涡

旋振荡器、移液枪及枪头、1.5ml离心管、制冰机、三角推棒、酒精灯、细菌培

养管、电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统等。。

2.试剂

1）用BamHI和XbaI处理的线状pSV质粒DNA（20ng/ul）

2）用BamHI和XbaI处理的4.8kbc-mycDNA片段（20ng/ul）

3）已连接好c-myc目的片段的pSV重组质粒DNA（5ng/ul）

4）T4DNA连接酶（5U/ul）及10×连接酶缓冲液（Thermo公司）

5）LB培养基以及含琼脂的LB培养基铺制的平板（含抗生素）

6）0.1mol/LCaCl溶液

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7）AxyPrep质粒DNA小量试剂盒（Axygen公司产品）

8）无水乙醇

9）BamHI（10ug/ul）及XbalI（10ug/ul）（NEB公司产品）

10）10×Buffer4（NEB公司产品）

11）1×TAE（0.04mol/LTris-乙酸；0.001mol/LEDTA）

12）γDNAHindIIIMarkers（0.1ug/ul）（Thermo公司）

13）6×凝胶加样缓冲液（0.25%溴酚蓝；40%（w/v）蔗糖水溶液）

14）氨苄青霉素储存液（100mg/ml）

15）CelRed核酸染料（10000×inwater）（Biotium公司产品）

四、实验步骤

1.目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接

目的基因片段（4.8kb），25ng/ul4ul

载体DNA（3.5kb），25ng/ul4ul

10×buffer1ul

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