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人NKX2-3基因真核表达载体的构建及其对肿瘤细胞生长的作用

[摘要]目的：构建人抑癌基因NKX2-3的真核表达载体，并验证其对肿瘤细胞生长的影响。

方法：采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人NKX2-3基因，将其克隆到Flag-pcDNA3.0载体中，

酶切和测序验证后转染人胚肾293T细胞，通蛋白免疫印迹鉴定其表达；转染人结肠癌细胞HCT-116

和肝癌HepG2细胞，通过CCK8法测定细胞生长曲线。结果：从人乳腺文库中扩增得到约1080bp

的DNA片段，并成功克隆至Flag-pcDNA3.0载体上，且测序与目的序列完全一致；转染人胚肾293T

细胞后，目的基因成功表达；细胞生长曲线结果显示，转染flag-NKX2.3的J结肠癌、肝癌细胞较

空载体细胞生长慢。结论：成功构建了flag-NKX2.3真核表达载体，为进一步研究NKX2.3在肿瘤

中的功能奠定基础。

[关键词]人NKX2-3基因；克隆；真核表达；肿瘤细胞

Constructionofflag-TaggedHumanNKX2-3EukaryoticExpressionVectorand

detectionofroleoftumorcellgrowth

［Abstract］Objective:ToconstructtheeukaryoticexpressionvectorofhumanNKX2-3labeledwith

fromhumanmammarycDNAlibrarybyPCRandclonedintoflag-pcDNA3.0vector.Therecombinant

plasmidflag-NKX2.3wasidentifiedbyenzymedigestionandsequencing,transfectedintocolorectal

investigateflag-NKX2.3

whichweresupposedtobeinhibitedbyflag-NKX2.3wasidentifiedbyitsexpression.Results:the

NKX2.3proteinwasexpressedinhumanHCT-116andHepG2cellsshownbyWesternblot.Cell

cells.Conclusion:Theeukaryoticex-pressionvectorofflag-NKX2.3wassuccessfullyconstructed

［Keywords］humanNKX2.3gene;cloning;eukaryoticexpression

NK2转录因子相关基因位点3（NKX2-3）是同源结构域转录因子NKX家族中的重要成

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员，可调节细胞特异性基因的表达，参与组织的分化和发育[1-3]。研究显示NKX2-3不仅影响肠

道免疫炎症反应，是炎性肠病（IBD）相关性性基因[4-5]，而且可能通过调节Wnt信号通路实现

调节细胞增殖、生长以及肿瘤形成等作用，从而参与散发性和IBD相关结直肠癌的发病[6]。因此

我们决定构建带flag标签的NKX2-3真核表达载体，并探讨其对结肠癌、肝癌细胞生长的影响，

为后续的研究奠定一定的基础。

1材料和方法

1.1材料

大肠杆菌DH5α,带flag标签的pcDNA3.0载体、人结肠癌HCT-116细胞系、人肝癌HepG2细

胞系、人胚肾293T细胞系由本室传代培养；人乳腺文库由本室保存；XhoI、HindIII限制性内切

酶、T4DNA连接酶为TaKaRa公司产品；PCR回收试剂盒、质粒提取、胶回收试剂盒为Promega

公司产品；VigoFect为威格拉斯生物技术有限公司产品；胎牛血清、DMEM为Gibco公司产品。

引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成；测序由北京博迈德生物技术有限公司完成；HRP标记

的小鼠抗FlagM2标签的单克隆抗体为Sigma公司产品。

1.2方法

1.2.1Flag-pcDNA3.0-NKX2.3重组质粒的构建与测序

根据NCBI查询的NKX2-3编码序列（NC_