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原核蛋白的表达、分离和纯化

实验原理：

携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG

诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移

酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍

离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析

（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

实验材料：

大肠杆菌BL21

试剂、试剂盒：

LB液体培养基、氨苄青霉素、WashingBuffer、ElutionBuffer、IPTG、

蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠

仪器、耗材：

摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒

实验步骤：

一、试剂准备

1.LB液体培养基：Trytone10g，yeastextract5g，NaCl10g，用蒸馏

水配至1000mL。

2.氨苄青霉素：100mg/mL。

3.上样缓冲液：100mMNaH2PO4，10mMTris，8MUrea，10mM

2-ME，pH8.0。

4.WashingBuffer：100mMNaH2PO4，10mMTris，8MUrea，pH6.3。

5.ElutionBuffer：100mMNaH2PO4，10mMTris，8MUrea，500mM

Imidazole，pH8.0。

6.IPTG：100mMIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38gIPTG溶

于100mlddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、获得目的基因

1.通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计

一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环

获得所需基因片段。

2.通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以

mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行

PCR循环获得产物。

三、构建重组表达载体

1.载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行

双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大

片段。

2.PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

四、获得含重组表达质粒的表达菌种

1.将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或

蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴

定。

2.测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。

否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3.以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

五、重组蛋白的诱导

1.接种含有目的基因蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mLLB液体培养

基中（含100ug/mL氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。

2.按1∶50或1：100的比例稀释过夜菌，一般转接1mL过夜培养物

于100mL（含100ug/mL氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡

培养至OD600=0.6-0.8（最好0.6，大约需3h）。取10ul样品用于

SDS分析。

3.对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG至终浓度0.5mmol/l，37℃继

续培养1-3h。

4.12000rpm离心10min，弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱

中。

六、重组蛋白的分离、纯化

1.NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mLNTA介质，并分别用8mL

去离子水，8mL上样缓冲液洗涤。

2.重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5mL上样缓

冲液，用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样

品60min，4℃12000rpm离心30min，将上清吸至一个干净的容器中，

并弃沉淀。取10ul上清样品用于SDS分析。

3.上清样品以10-15mL/h流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10ul

样品用于SDS分析。

4.洗脱杂蛋白：用WashingBuffer以10-15mL/h流速洗柱，直至OD280

=0.01分步收集洗脱液，约3-4h，取10u