灰葡萄孢BcKMO基因的原核表达分析 .pdfVIP

灰葡萄孢BcKMO基因的原核表达分析

王敏;刘媛媛;周帆;姜婷婷;郑旭;张靖;时翠平;邢继红;董金皋

【摘要】TheaimofthisstudyisprokaryoticexpressionanalysisofBcKMO

genefromBotrytiscinereaandobtainthepurifiedBcKMOprotein.The

BcKMOgenewasamplifiedbyRT-PCRtechnologyusingthecDNAofthe

BotrytiscinereawildtypeBC22,clonedintothepMD19-Tvectorand

sequenced.TheresultsofsequencingshowedthattheBcKMOgene

sequencewasright.ThepMD19-T-BcKMOandpGEX4T-1plasmidswere

digestedusingrestrictionenzyme.TheBcKMOgenesegmentswere

collectedandclonedintothepGEX4T-1vector.Theresultsofrestriction

enzymedigestionandsequencingshowedthatthevectorpGEX4T-1-

BcKMO-GSTwassuccessfullyconstructed.ThevectorpGEX4T-1-BcKMO-

GSTwastransformedintoE.coliBL21strain.TheresultsofIPTGinducement

indicatedthatthepGEX4T-1-BcKMO-GSTwassuccessfullyexpressedin

E.coliBL21strain,withthemolecularweight71kDa.Theoptimalconditions

oftheprokaryoticexpressionofBcKMOweredeterminedas0.2mmol/L

IPTGtreatment12h.WesternBlotresultsshowedthattheGSTantibody

couldspecificallyboundtopurifiedpGEX4T-1-BcKMO-GSTfusion

protein,suggestingthattheexpressionofBcKMOgenewassuccessfullyin

vitro.%为构建灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶(BcKMO)基因的原核表达载体并进行高

效表达,获得纯化的BcKMO蛋白.以灰葡萄孢野生型BC22为试材,通过反转录PCR

扩增BcKMO基因,回收BcKMO基因片段克隆到pMD19-T载体中,测序正确后,酶

切pMD19-T-BcKMO和带有GST标签蛋白的pGEX4T-1质粒,将目的片段进行连

接,构建BcKMO基因的原核表达载体pGEX4T-1-BcKMO-GST.经酶切和测序鉴定

正确后,将构建好的原核载体转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21菌

株中成功表达了与GST标签蛋白融合的BcKMO蛋白,大小约71kDa.SDS

分析表明,该蛋白在0.2mmol/LIPTG诱导12h时高效表达;WesternBlot结果发

现目的蛋白能与GST特异性抗体起特异性反应,表明BcKMO基因的体外诱导表达

成功.

【期刊名称】《华北农学报》

【年(卷),期】2017(032)001

【总页数】5页(P68-72)

【关键词】灰葡萄孢;BcKMO;原核表达;纯化;PCR

【作者】王敏;刘媛媛;周帆;姜婷婷;郑旭;张靖;时翠平;邢继红;董金皋

【作者单位】河北农业大学,真菌毒素与植物分子病理学实验室,河北保定071001;

河北农业大学,真菌毒素与植物分子