17 重组克隆的筛选.ppt

*一抗？现在的抗体产品说明书一般都有注明应用范围的，说明可以用于WB的就OK。如果没有这些信息可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过SDS变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。如果还有多种抗体选择，那当然是来源于兔或者小鼠抗体为好，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而选择范围更大通用性也更强。除了无标记的一抗，还有生物素等各种标记一抗。还听说有用荧光标记的一抗直接检测而降低背景和非特异结合，不过由于少了二抗的级联放大信号扩增，信号也会比较弱，所以需要选择荧光信号特别明亮的标记（Invitrogen收购了著名的MolecularProbes后有推出AlexaFluor的抗体标记试剂盒，生物通这里有详细而精彩的介绍，我们就不罗嗦了。毕竟不是WB的主流方法。）一抗的稀释度通常需要预实验摸条件，可以根据说明书上建议的WB稀释度附近做2—3个梯度，如果是用化学发光法检测，由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些。???二级试剂的作用是信号扩增，选择是根据一抗的标记形式而决定的，对于无标记的一抗，可以选择对应一抗来源种属的标记二抗，或者更便宜的标记蛋白A（来自金黄葡萄球菌ProteinA可以高度亲和来自人，兔，豚鼠的IgG，但对大鼠、山羊和鸡的IgG亲和力弱）。不过，二抗是更可靠的选择——除了要选择对应一抗的来源种属，也要根据你准备采用的检测方法选择合适的标记。

?????酶促反应比同位素安全且快速，已经成为WesternBlot的主流检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高——随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到pg级别，甚至还有Femto级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。最为大家熟悉当数辣根过氧化物酶HRP（HorseradishPeroxidase，属于过氧化物酶POD类）和碱性磷酸酶AP（AlkalinePhosphatase），此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶（GlucoseOxidase）、β半乳糖苷酶β-Galactosidase。.HRP辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物2大类。对于底物的选择，主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性——比如底物可溶性高使用就比较方便；对于WB来说产物不可溶有助于信号在原位的积累和结果的稳定（产物可溶的底物更适合于Elisa）。???HRP的生色底物显色有DAB，4-CN，CN/DAB，AEC和TMB等（而得到可溶性产物的底物如OPD，ABTS等则适用于ELISA）中，与化学发光法中的酶促基团发光不同，底物显色主要是利用底物在有HRP和过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测WB的结果。重组克隆的筛选*1、抗药性筛选；2、蓝白斑筛选；3、酶切电泳筛选(*)；4、PCR筛选；5、测序验证；6、核酸分子杂交检测；7、表达筛选；8、生物活性筛选。抗药性筛选

--质粒载体携带的筛选标记1.AmpR（氨苄青霉素抗性）2、TetR(四环素抗性）3、KanR(卡那霉素抗性)特点：一般用抗性培养基做初级筛选，只能保证有载体转入，不能保证外源基因插入。克隆的Amp抗性筛选重组DNA操作过程示意图蓝白斑筛选

－－β半乳糖苷酶(LacZ)的显色反应一、α互补：LacZ由4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性），载体表达一部分（无活性），合在一起构成有活性的LacZ,可分解培养基平板中的底物X-gal,生成蓝色物质。（需要IPTG诱导表达）－－蓝斑；二、外源基因插入载体后，使载体部分LacZ失活，无法进行α互补－－白斑。（√）三、特点：1、未转入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选；2、无法确定基因插入的方向；3、特殊：基因过小，且读框正确，可能无法使载体部分LacZ失活，将产生α互补，产生蓝斑。酶切电泳筛选(*)一、选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA片断的大小。二、特点：1、可鉴定外源基因的重组和插入方向。2、结果可靠但操作比较麻烦；3、无法检测基因内部的突变。EcoR1和Xho1双酶切筛选PCR筛选1、通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质粒。二、特点：1、可用2ul菌液做模板，快速，方便，可批量检测。2、不能检测基因内部