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HER-2基因特异性核酶设计与体外转录载体构建

姜锐;罗速;樊丽

【摘要】目的构建人表皮生长因子受体-2(HER-2)特异性核酶(ribozyme,RZ)及其

底物基因的体外转录载体.方法设计合成RZ基因,将该RZ克隆到真核表达载体

pcDNA3.1(+)中,测序鉴定.应用Trizol试剂提取MDA-MB-453细胞总RNA,RT-

PCR扩增靶基因HER-2cDNA片段,同样插入载体pcDNA3.1(+),测序鉴定.结果

经DNA测序分别证实合成的RZ基因序列和通过RT-PCR扩增的HER-2cDNA

序列克隆入pcDNA3.1(+)中.结论构建HER-2特异性RZ真核表达载体及含有

HER-2cDNA的载体,有助于进一步研究RZ对靶基因切割作用及雌激素受体阴性

乳腺癌细胞MDA-MB-453中HER-2信号转导通路.

【期刊名称】《北华大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2008(009)005

【总页数】3页(P417-419)

【关键词】人表皮生长因子受体-2(HER-2);锤头状核酶;基因治疗

【作者】姜锐;罗速;樊丽

【作者单位】北华大学,基础医学院,吉林,吉林,132013;北华大学,基础医学院,吉林,

吉林,132013;北华大学,基础医学院,吉林,吉林,132013;齐齐哈尔医学院,黑龙江,齐

齐哈尔,161042

【正文语种】中文

【中图分类】R737.9

雌激素受体阴性乳腺癌恶性程度比较高，对内分泌治疗具有效率低，易转移复发，

预后较差，生存率较低等特点，因而成为研究的热点和难点问题之一[1].在雌激素

受体阴性乳腺癌中，人表皮生长因子受体-2(HER-2)[2-4]常常呈现高表达状态，进

行雌激素受体阴性乳腺癌HER-2及其相关因子的研究，有助于确定HER-2在雌激

素受体阴性乳腺癌细胞生长、增殖及乳腺癌从激素依赖型转变为非激素依赖型中的

作用，寻找可能的治疗靶点.

本研究根据HER-2基因序列，设计并合成核酶基因，构建HER-2基因特异性锤头

状核酶真核表达载体，为检测该核酶在体外对靶基因HER-2的作用，研究雌激素

受体阴性乳腺癌细胞中HER-2信号转导途径相关因子的相关性及其分子机制和

HER-2作为肿瘤基因治疗靶点提供实验与理论依据.

1材料与方法

1.1材料

限制性内切酶、DNA连接试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、RT-

PCR试剂盒均购自Takara公司；MDA-MB-453细胞购自中国科学院上海生命科

学研究院细胞库；RPMI-1640培养基、DEPC、Trizol总RNA提取剂为

Invitrogen公司产品；体外转录试剂盒为promage公司产品.

1.2方法

1.2.1核酶的设计

用计算机人工设计HER-2特异性核酶.选择HER-2mRNA基因序列(NM-004448)

第2502位点的GTT为核酶切割位点，在核酶基因序列两端分别加上BamHⅠ和

EcoRⅠ限制性内切酶位点及保护碱基.以核酶基因的非模板链为HA链，模板链为

HB链，经设计后的核酶基因序列共58bp.

HA链：5’-

GCGGAATTCTTTCCCTCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACACTTTGATGGAT

CCCGC-3’；

HB链：5’-

GCGGGATCCATCAAAGTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGAGGGAAAGAA

TTCCGC-3’.

1.2.2核酶基因的合成

设计核酶基因HA链和HB链，并由上海生物工程技术服务有限公司合成，取50

μLA，B链混合经95℃加热变性5min，逐渐冷却到室温，退火形成互补双链，

命名为RZ基因.

1.2.3核酶基因重组子的构建及鉴定

RZ基因与pcDNA3.1(+)载体EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切消化，并经凝胶回收.将

RZ基因和pcDNA3.1(+)载体按摩尔比10∶1混合进行连接反应后，转化入大肠

杆菌JM109，挑取单个菌落提取