bFGF基因体外转染缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞研究 .pdfVIP

bFGF基因体外转染缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞研究

【摘要】目的:用Lipofectamine转染试剂介导,将重组真核表达质粒

pIRES2-EGFP-bFGF转染体外培养的缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞,

检测转染效果及目的基因的表达情况。材料与方法:抽取临床确诊缺血性心肌病

患者髂嵴骨髓,贴壁分离法接种培养骨髓基质干细胞。绘制生长曲线。MTT比色

法检测细胞活力。取第二代细胞,使用Lipofectamine转染试剂,将重组真核表达质

粒pIRES2-EGFP-bFGF转染骨髓基质干细胞,转染后4h、12h、24h、48h、

72h以及传代后分别用倒置荧光显微镜观察标志基因增强绿荧光蛋白的表达效

率及荧光强度的变化,计算转染效率。取各观察时间点的培养上清液,酶联免疫吸

附试验检测其中bFGF的浓度。转染细胞爬片行bFGF免疫组化染色检测bFGF

的表达。结果:缺血性心肌病患者基质干细胞在接种后24小时开始贴壁,伸展成长

梭形。MTT比色法测细胞活力达96%。在不同时间点观测EGFP表达情况,发现

在转染后4h即有细胞表达绿色荧光蛋白,荧光强度和表达细胞总数在48h达高

峰,72h时可见部分细胞荧光强度下降,传代后仍可观察到EGFP的表达。ELISA

检测不同时间点转染上清液中分泌的bFGF浓度,结果在4h-48h内浓度呈渐进上

升的趋势,在48h最高可达23.5ng/ml。转染后的部分细胞形态发生变化。转染细

胞爬片行bFGF免疫组化染色证实在胞浆中有bFGF颗粒着色阳性。结论:使用

Lipofectamine转染试剂可有效地转染体外培养的缺血性心肌病患者骨髓基质干

细胞。转染后的培养上清可在较长时间内检测到较高浓度的bFGF的分泌。bFGF

基因转染可促进骨髓基质干细胞的增殖、分化。

【关键词】基质干细胞;碱性成纤维细胞生长因子;缺血性心肌病;转染

骨髓基质干细胞(Bonemarrowstemcells,BMSCs)是在骨髓中存在的一类具

有多向分化潜能的细胞总称,在成体动物中仍具有在特定条件下向特定组织分化

的能力。正是由于骨髓基质干细胞具有向多种细胞分化的可能,并且在体外扩增

迅速、来源广泛等优点,因此便成为组织工程法修复各种病损的理想种子细胞,但

将其作为基因治疗的靶细胞的研究较少。它在骨髓中仅占0.25%,在成年机体中约

占有核细胞的十万分之一。本实验通过脂质体介导碱性成纤维细胞生长因子基因

转染体外培养的缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞,观察目的基因和标记基因在

BMSCs中的表达情况,并观测转染对其生长增殖及表型所带来的影响。

1.材料与方法

1.1骨髓基质干细胞的体外单层培养及生长特性的检测。随机选取临床确诊

为缺血性心肌病的患者,征得患者同意后,在局部麻醉下用肝素预处理过的骨髓穿

刺针于髂嵴处穿刺,抽取骨髓4～6ml,置于含有15mlα-MEM(内含10%胎牛血

清,100u/ml青霉素钠,100μg/ml链霉素),和肝素的液体中混匀。分2～3部分接种

于10cm培养皿,于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。倒置相差显微镜观察

细胞形态及增殖情况。16～18天细胞接近80%融合时传代。台盼蓝拒染试验检

测细胞活性。进行生长曲线的描记。

1.2Lipofectamine介导重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-bFGF转染。

转染前一天将2×105细胞接种于覆盖有清洁载玻片的35mm2培

养皿内。加入2ml含10%FBS的α-MEM培养基,37℃、5%CO2、饱和

湿度培养至呈60%-80%融合时转染。按说明书制备α-MEM、Lipofectamine和质

粒的混合物,室温孵育后加入细胞中混匀。

1.3转染结果的检测。

1.3.1倒置荧光显微镜观察:转基因后,在暗室中用倒置荧光显微镜

(OLYMPUSIX70),分别在转染后4小时、12小时、24小时、48小时、72小时,

传代后24小时观察细胞中增强绿荧光蛋白(EGFP)的表达情况,采用488nm波长

紫外光激发。

1.3.2转染效率的计算:沿6孔板垂直与水平经过连续视野计数EGFP阳性的

细胞数,如果转染效率极低,如低于1%,则