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Dbl基因家族

最早发现的Dbl分子是proto-Dbl,以其强烈的恶性转化能力成为Dbl家族之

父。第一个Dbl家族癌基因发现于弥漫性B细胞淋巴瘤,此后,又发现一系列与

Dbl分子结构与功能类似的基因,组成Dbl家族癌基因。Dbl家族癌基因可以通过

激活下游的Rho家族蛋白而引起细胞的生长、转化、侵袭和转移,是典型的癌基

因家族。Dbl家族癌基因在许多肿瘤的发生发展中起着决定性的作用。Dbl家族成

员在结构上一般具有DHdomain和紧随其后的PHdomain,只有DH-PH一起才能引

起细胞的恶性转化。因此,DH-PH即为Dbl家族成员基本的功能单位。正常情况下

Dbl家族成员处于自我抑制状态,在出现N末端或C末端截断突变后激活,具有强

烈的鸟苷交换因子(GEF)活性。研究发现,proto-DblN端的1-348个氨基酸(VL

domain)通过与中间的PH域结合而抑制了Dbl的活性和致癌作用,一旦出现N端的

截断性突变,即变为很强的癌基因而持续性激活下游效应分子RhoA和Cdc42从

而引起细胞的恶性转化而发生肿瘤。近年来国际上对Dbl的上游活性调控机制的

研究也基本上集中在N末端上,所得结论均认为N末端是调节Dbl活性的关键

功能域,并由上游信号对N末端产生影响进而调控Dbl的GEF活性,但是具体的调

控分子一直不明确。

因此,深入对proto-Dbl的活性调控研究,特别是N末端的研究是进一步了解

Dbl分子GEF活性调控的关键,为肿瘤发生发展中的信号调控机制和肿瘤分子靶

向治疗方法上提供可靠的理论依据,DH可以独立完成Rho家族蛋白由GDP形式向

GTP形式的转化(即激活Rho家族蛋白的GEF活性);PH的主要功能是与细胞膜的相

关分子结合以将这些GEFs导向Rho家族蛋白丰富的细胞膜区。

Proto-Dbl基因序列(X12556)用primerpremier5.0软件设计引物:

上游引物:5`-CCGGAATTCATGGCAGAAGCAAATCCCCGG-3`;

下游引物:5`-CGGGGATCCCTAGTTCTTTAAAACATCCAAGCT-3`;

GST-pulldown技术原理

GST-pulldown技术是在GST融合蛋白的基础上发展起来的，GST能与谷胱甘肽特异

性结合，其作为表达标签蛋白，能促进原核表达蛋白的正确折叠及可溶性表达。

GST-pulldown主要包括以下3部分：①利用基因重组技术构建带有GST标签的原核

表达载体；②通过原核表达系统表达带有GST标签的融合蛋白；③利用GST亲和

纯化柱进行蛋白纯化，获得高纯度的融合蛋白；再利用GST亲和纯化柱进行蛋白

间的相互作用检测。

注：①获得带有GST标签的融合蛋白；②将带有GST标签的融合蛋白亲和到谷胱甘肽层

析柱上；③获取可能与融合蛋白发生相互作用的蛋白；④与融合蛋白发生相互作用的蛋白被

亲和到谷胱甘肽层析柱上；⑤切掉标签，洗脱得到相互作用的蛋白。

GST-pulldown技术在体外验证蛋白间直接的相互作用时有较强的特异性，

但存在一定的局限性，GST-pulldown技术不能用于大规模的蛋白间相互作用的

筛查；内源性蛋白的干扰使实验结果出现假阳性。因此要求在实验中充分考虑可

能对实验结果造成影响的因素，以减少假阳性的出现。

Co-Immunoprecipitation

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为

基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生

理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细

胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的

抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的

proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应

后，beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种

目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。