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荧光定量PCR技术的使用教程

PCR（聚合酶链式反应）技术是分子生物学中常用的实验手段之一，它可以扩

增起始序列的DNA片段。荧光定量PCR技术是PCR技术的一种改进方法，它结

合了PCR扩增和荧光检测技术，可以对扩增产物进行精确的定量分析。本文将详

细介绍荧光定量PCR技术的使用步骤和相关注意事项。

第一步：准备实验材料与试剂

在进行荧光定量PCR实验前，首先需要准备好以下实验材料和试剂：

1.DNA模板：可以是DNA提取物、血浆、组织样本等。

2.引物（Primer）：引物对应于目标序列的两端，用于扩增DNA片段。应选

择合适的引物，包括正向引物和反向引物。

3.标记荧光的探针（Probe）：探针可以是DNA分子、RNA分子或合成的寡

核苷酸，用于检测PCR扩增产物。

4.dNTPs混合液：包含dATP、dCTP、dGTP和dUTP。

5.磷酸缓冲液：用于维持PCR反应的酸碱平衡。

6.DNA聚合酶：用于酶切和DNA复制。

7.MgCl2：用于在PCR反应体系中提供镁离子。

8.蒸馏水：用于稀释试剂和制备反应体系。

第二步：制备PCR反应体系

1.在无菌试管中依次加入如下试剂，制备PCR反应体系：

1μLDNA-模板

1μL-正向引物

1μL-反向引物

0.5μL-荧光探针

10μL2×PCR-反应缓冲液

0.5μL10mMdNTPs-混合液

0.2μLDNA-聚合酶

1μL25mMMgCl2-

35.8μL-蒸馏水

注意：根据实验需求和试剂浓度的不同，反应体系中有时需要调整试剂的用

量。

2.轻轻混匀试管中的液体，避免形成气泡。

第三步：进行PCR扩增反应

1.将PCR反应体系分装至PCR管或96孔板中。

2.将PCR管或96孔板放入PCR仪中，并设置合适的PCR程序。

初始变性：-95°C，5分钟

循环变性：-95°C，30秒

退火温度：根据引物的-Tm值进行调整，通常为50-65°C，持续30秒

延伸：-72°C，持续1分钟

终止延伸：-72°C，10分钟

3.根据需要，可以设置PCR程序的循环次数。通常，25-35个循环周期足以扩

增目标序列到足够数量。

第四步：结果分析

1.使用荧光定量PCR系统读取PCR产物荧光信号。根据实验需求，可以选择

实时监测PCR反应过程中的荧光信号。

2.通过正反标准曲线法定量PCR产物浓度。制备一系列已知浓度的标准品，

构建一个标准曲线。根据待测样品PCR反应的荧光信号，使用标准曲线法计算

PCR产物的浓度。

3.注意，PCR反应的荧光信号可能受到多种因素的影响，如PCR反应体系的

pH值、反应温度、产物的浓度等。因此，实验过程中应注意控制这些因素的变异

性。

第五步：优化PCR反应条件

1.如有必要，可以优化PCR反应条件，以提高PCR反应的效率和特异性。优

化方案包括：

引物浓度的调整和优化-

-Mg2+离子浓度的调整和优化

-PCR反应的循环次数的调整和优化

-PCR反应的退火温度的调整和优化

-DNA模板和PCR反应体系的预处理等

2.通过优化PCR反应条件，可以提高PCR扩增的效率和特异性，并获得更准