DB22T 2812-2017 番茄细菌性溃疡病病原检测 LAMP法.docxVIP

ICS65.020B05

备案号：59176-2018DB22吉林省地方标准

DB22/T2812—2017

番茄细菌性溃疡病病原检测LAMP法

Detectionforbacterialcankeroftomatopathogen—LAMPmethod

2017-12-11发布2018-04-01实施

吉林省质量技术监督局发布

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DB22/T2812—2017

前言

本标准按照GB/T1.1—2009和GB/T20001.4—2015给出的规则起草。本标准由吉林省农业委员会提出并归口。

本标准起草单位：吉林省蔬菜花卉科学研究院。

本标准主要起草人：毛芙蓉、王利波、刘燕妮、郑士金、李欣敏、潘博、郑建超、王剑锋、娄琦、王志琴。

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DB22/T2812—2017

番茄细菌性溃疡病病原检测LAMP法

1范围

本标准规定了番茄细菌性溃疡病病原LAMP检测的原理、试验条件、试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤、试验结果观察、质量保证和控制、试验报告。

本标准适用于番茄种苗、植株和果实中番茄细菌性溃疡病病原的定性快速检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测NY/T2286番茄溃疡病菌检疫检测与鉴定方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

番茄细菌性溃疡病bacterialcankeroftomato

由密执安棒形杆菌密执安亚种（Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis）引起的一种维管束病害，从番茄苗期到收获期均可发病。该病害病原的分类地位、寄主范围、地理分布、危害症状及传播途径参见附录A。

3.2

环介导等温扩增loop-mediatedisothermalamplification(LAMP)

LAMP是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在BstDNA聚合酶作用下，以特异性引物为延伸起点，在60℃~65℃恒温条件下通过链置换反应进行的DNA扩增方法，扩增产物是一系列复杂的大小不等的DNA混合物。

4原理

4.1一般原理

根据番茄细菌性溃疡病原的特异性基因tomA的核苷酸序列（GenBank登录号为HE861510），设计LAMP内引物、外引物和环引物各一对，特异识别tomA基因的六个独立区域。在反应溶液中加入含有靶标核苷酸序列的DNA，在BstDNA聚合酶的作用下启动链置换反应，生成茎环DNA混合物。扩增反应结束后加入SYBRGreenI荧光染料，即可通过产物双链DNA与染料结合后颜色变化，观察判定结果。

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4.2显色原理

SYBRGreenI是一种高灵敏度的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的800～1000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变成绿色。

5试验条件

常规实验室条件。

6试剂或材料

6.1LAMP引物，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2、环引物1和环引物2，其核苷酸序列分别为：

——外引物1：5’-CGCTGGGCTTGACCGA-3’

——外引物2：5’-CCCACCGATCGATCCTTCC-3’

——内引物1：5’-TACTCCGGATCGCAGCAGCTAGAGCACGACATGGCGG-3’

——内引物2：5’-CGTGACCTCGATCACGGATGCGTAACGCTCCATCACAGTGG-3’——环引物1：5’-GGAGATCAGACCATGGCCCTTTA-3’

——环引物2：5’-GCGGCGATGACAGAGCA-3’注