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化妆品抗过敏实验（鱼胚实验）实验方法

1.范围

本标准规定了化妆品致敏性斑马鱼鱼胚实验的实验原理、实验准备、实验

方法、实验结果和实验报告。

本标准适用于液态水基类、膏霜乳液、凝胶类、可溶性粉剂化妆品原料及

其产品的致敏性检测。

2.定义

hourspost-fertilization(hpf)：受精后小时数

3.规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本(包括所

有的修改单)适用于本文件。

化妆品安全技术规范2015版

GB/T6678化工产品采样总则

GB/T6679固体化工产品采样通则

4.检测原理

肥大细胞是类过敏反应的主要效应细胞，激活的肥大细胞数量与过敏程度相关，激活的肥大细胞越多，过敏程度越严重。类胰蛋白酶(Tryptase)是肥大细胞内预先合成的中性蛋白酶，是含量最多的介质，经肥大细胞脱颗粒释放到细胞外，其在肥大细胞中的储存和表达有高度的选择性，可作为肥大细胞的激活和脱颗粒的标志。斑马鱼鱼胚的肥大细胞，其结构与功能与哺乳类动物相似，参与机体的免疫反应和过敏反应。N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)是类胰蛋白酶(Tryptase)特异性底物，可以检测斑马鱼体内的类胰蛋白酶(Tryptase)表达水平。检测受试样品诱导斑马鱼鱼胚体内24小时内的类

胰蛋白酶(Tryptase)表达水平，可以定量分析受试样品的致敏性。

5.实验材料与试剂

5.1.材料

5.1.1.斑马鱼交配盒

5.1.2.鱼胚收集器

5.1.3.细胞培养板：96孔细胞培养板

5.2.试剂

5.2.1.二甲基亚砜

5.2.2.N-甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醛缩合产生的聚合物(Compoud48/80)

5.2.3.氢氧化钠

5.2.4.三(羟甲基)氨基甲烷

5.2.5.N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)

5.2.6.二甲基亚砜标准储备液（1%）：量取二甲基亚砜标准品1.0mL（精确至0.1mL），用斑马鱼系统养殖水稀释并定容至100mL容量瓶，于28℃保

存。

5.2.7.N-甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醛缩合产生的聚合物(Compoud48/80)标准储备溶液(100μg/mL)：称取标准物质N-甲基-对甲氧基苯乙胺和甲醛缩合产生的聚合物(Compoud48/80)10mg(精确至0.01mg)，用斑马鱼系统养

殖水溶解并定容至100mL容量瓶，于4℃保存。

5.2.8.氢氧化钠（1mol/L）溶液配制：称取氢氧化钠10mg（精确至0.01mg），

用斑马鱼系统养殖水溶解并定容至250mL容量瓶，于28℃保存。

5.2.9.三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris溶液)(1mol/L)：称取三羟甲基氨基甲烷60.5g，加入斑马鱼系统养殖水约950mL溶解，用氢氧化钠溶液（5.2.8）调节pH

值至12.6，并用斑马鱼系统养殖水定容至500mL容量瓶，于28℃保存。

5.2.10.N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)储备溶液(1mg/mL)：

称取N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)10mg(精确至

0.01mg)，用少量二甲基亚砜溶液溶解并加入三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-H

CL缓冲液)(5.2.9)稀释定容至10mL容量瓶，于4℃保存。

5.3.对照品

5.3.1.色甘酸钠标准品，纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准

物

5.3.2.色甘酸钠标准储备溶液(100μg/mL)：称取标准物质色甘酸10mg(精确至

0.01mg)，用斑马鱼系统养殖水溶解并定容至100mL容量瓶，于4℃保存。

6.实验仪器与设备

6.1.斑马鱼养殖系统

6.2.连续变倍体式显微镜(带拍照功能)

6.3.恒温培养箱

6.4.天平：精密度0.00001g

6.5.全波长酶标仪

6.6.软件：SPSS统计分析软件、Origin函数绘图软件

7.实验步骤

7.1.实验准备

7.1.1.鱼胚品系：野生型AB系斑马鱼自然交配的胚胎；

7.1.2.鱼胚要求：以斑马鱼开始交配受精为0hpf，选用72hpf健康、无畸形、

正常发育的鱼胚用于实验；

7.1.2.1.胚胎畸形表现形式为：脊柱弯曲，心胞水肿，尾部弯曲，血管堵塞等。

7.1.2.2.胚胎死亡表现形式：胚胎的凝固，体节形成缺失，尾未分化和心跳缺失

等。

7.1.3.鱼胚孵育温度：2