禽网状内皮组织增生症病毒蛋白酶PR酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定.pdfVIP

禽网状内皮组织增生症病毒蛋白酶PR酵母双杂交诱饵载体的

构建及鉴定

姜莉莉;蒋培红;温海燕;樊兆斌

【摘要】为研究禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosisvirus,REV)蛋

白酶PR与宿主细胞的相互作用,将REVPR基因克隆入酵母双杂交诱饵载体

pGBKT7,构建诱饵载体pGBK-PR,经菌落PCR、酶切鉴定及测序验证正确后,将重

组诱饵质粒转化酵母菌株Y2HGold感受态,进行重组诱饵载体在酵母中的自激活

活性和毒性检测.结果表明,成功构建诱饵载体pGBK-PR,此载体在酵母细胞Y2H

Gold中无自激活活性和毒性.研究结果为进一步利用酵母双杂交技术筛选与REV

蛋白酶PR互作的宿主蛋白奠定了基础.

【期刊名称】《中国兽医杂志》

【年(卷),期】2017(053)005

【总页数】4页(P27-29,33)

【关键词】禽网状内皮组织增生症病毒;PR;酵母双杂交;诱饵载体

【作者】姜莉莉;蒋培红;温海燕;樊兆斌

【作者单位】菏泽学院药物科学与技术系,山东菏泽274015;锦州医科大学畜牧兽

医学院,辽宁锦州121001;菏泽学院药物科学与技术系,山东菏泽274015;菏泽学院

药物科学与技术系,山东菏泽274015;菏泽学院药物科学与技术系,山东菏泽

274015;锦州医科大学畜牧兽医学院,辽宁锦州121001

【正文语种】中文

【中图分类】S854.43

禽网状内皮组织增生症是由禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis

Virus,REV)引起的一种重要的肿瘤性免疫抑制病。REV感染能引起慢性肿瘤、矮

小综合征[1]。还可引起免疫器官的萎缩，引发重剧的免疫抑制，造成免疫失败或

继发其他传染病[2]。近年来，REV已在全球范围内流行[3]，在我国的流行愈发严

重，鸡群中REV的血清抗体阳性率逐渐增高，存在普遍的混合感染[4-5]，对养禽

业危害严重。

REV属反转录病毒科，哺乳动物C型反转录病毒亚科，γ逆转录病毒属，为双倍

体单股正链RNA病毒[6]。REV基因组有两个开放阅读框，有3个主要编码基因：

衣壳蛋白基因(gag)、聚合酶基因(pol)和囊膜蛋白基因(env)，主要编码gag、pol

和env三种结构蛋白[7]。pol基因主要编码REV的功能性蛋白，包括反转录酶

(RT)及其衍生的蛋白酶(PR)和整合酶(IN)等。PR的功能是水解前体蛋白以使之形

成成熟蛋白。目前，对REVPR研究较少，尚未见该蛋白与宿主细胞之间相互作用

的研究报道。为更好理解PR的生物学功能，本试验构建了REVPR酵母双杂交诱

饵载体，检测其是否在酵母细胞中表达，为利用酵母双杂交技术进一步开展该蛋白

与其他相关蛋白的相互作用研究奠定基础。

1.1菌株、质粒、主要试剂及引物pT-Rpol质粒由药物科学技术学院预防兽医学

研究室构建和保存；载体质粒pGBKT7、pGADT7，酵母菌株Y2H、X-α-Gal、

AureobasidinMinimalSDBase、MinimalSDAgarBase、Yeastmaker

CarrierDNA、酵母共转化试剂盒等，均购自Clontech公司；CEFcDNA酵母表

达文库由本研究室构建；DDO(SD/-Leu/-Trp)、QDO(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp)、

QDO/X/A(SD/-Ade/-His/-Leu/Trp/X-α-Gal/AureobasidinA)培养基按常规方

法制备；EcoRI、BamHI、T4DNALigase、DNA聚合酶等，均购自宝生物工程

(大连)有限公司；PR基因扩增引物由上海生工基因股份有限公司合成(见表1)。

1.2PR基因的扩增根据pGBKT7载体的多克隆位点，设计扩增REVPR的引物

RPRU/RPRL(上下游分别引入EcoRI和BamHI、酶切位点)，以pT-Rpol为模板

进行PCR扩增。PCR反应体系：5×PrimeSTARBuffer(Mg2+Plus)10μL，

dNTPMixture(each2.