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植物病原微生物的分离与纯化

一、实验目的

掌握培养基的制备方法，学习灭菌与消毒的操作方法

掌握分离与纯化病原微生物的基本原理与方法

实验原理

植物病原微生物的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。

植物患病组织内的微生物，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原微生物的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真微生物与其它微生物相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原微生物于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病微生物的分离培养。植物病原真微生物的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。

实验材料、试剂

芒果炭疽病叶、酒精灯，剪子，镊子，牛肉膏蛋白胨，培养皿，小烧杯，大烧杯，灭菌水，75%酒精瓶、0.1%升汞瓶

实验步骤

培养基的配置

取无菌平皿，将已熔化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。

2、植株挑选

用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料。

分离

①病叶或病枝经自来水冲洗，从病斑周转1-2毫米处的健组织部位剪下

②取10毫升小烧杯经酒带消毒，放入分离材料，倒入0.1%升汞液适量作表面消毒一分钟。

③消毒后倾出消毒液，用无菌水冲洗2——3，最后一次无菌水不要倒掉。

④用灭菌镊，剪在无菌水中将分离材料剪成2——3毫米大小的方块，每块组织均应为病健相间组织。用灭菌镊子夹取剪好的材料，放入培养基平板上，轻轻按压。每皿4——5块，排放均匀。

⑤将培养皿倒置，于23—25℃培养

⑥3——4日后挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，于25℃温箱中培养。

挑菌纯化

在平板上选择分离较好的有代表性的单菌落接种斜面，同时作涂片检查，若发现不纯，应挑取此菌落做进一步画线分离，或支撑菌悬液再做稀释分离，直至获得纯培养体。