分子生物学实验讲义(2020版-).doc

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《分子生物学》实验讲义

实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍

实验二质粒DNA分离纯化

实验三琼脂糖凝胶电泳

实验四聚合酶链反应(PCR)检测质粒DNA

实验五限制酶切鉴定质粒DNA

实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍

一、实验目的

了解分子生物学实验特点，了解分子生物学实验室常用设备及基本实验操作。

二、实验内容

分子生物学实验知识

⑴严格操作规程

分子生物学实验一般比较复杂，如所用试剂多、操作步骤多、实验时间长等，因此为保证实验效果，在实验室中一定要有整体观念，严格按照操作规程进行。

⑵耐心细致操作

实验中不能急于求成，特别是对于初入门者，应反复操作，积累经验。

⑶习惯微量操作

在分子生物学实验中，试剂的用量往往很少，常常细到1ul液体、ug或ng固体，这是平常肉眼很难看到的，所以刚刚接触实验的人往往感到不习惯，总是担心要取的东西能否看到、准不准确，操作的样品会不会丢失，总是想加大反应体积，以为越多越好。这些观念都是错误的。只有定时定量加入液体，才能保证实验成功，所以平时应加以练习，逐渐建立微量操作的观念才能解决好问题。

⑷防止实验污染

分子生物学实验的对象主要是核酸，不同生物材料的DNA和DNA之间，不同的样品之间，核酸酶等蛋白酶与核酸之间，产物与反应物之间都有可能造成污染，最终导致实验的失败。故要从所用试剂、仪器设备、耗材及操作人员等方面进行防止污染的操作。

⑸正确处理试剂

分子生物学实验中对试剂的要求十分严格，包括试剂的等级、配制、除菌储备等各方面均有严格要求。

⑹注意实验安全

分子生物学实验中，操作者常会接触一些对人体有害的试剂，必须实验安全要求进行实验操作，否则会给实验室甚至整个人类带来巨大的危害。

分子生物学实验常用仪器介绍

⑴微量取液器

⑵水纯化装置（离子交换器、超纯水装置）

⑶离心机（低速、高速、超速）

⑷电泳装置（电泳仪、电泳槽）

⑸灭菌设备（高压蒸汽灭菌锅、过滤除菌器）

⑹超净工作台

⑺PCR仪

⑻凝胶成像系统（紫外分析仪、核酸凝胶电泳图谱的记录）

⑼温度控制设备（冷冻设备、培养箱、水浴箱、烤箱）

⑽其它设备（紫外可见分光光度计、微波炉、凝胶干燥器、真空干燥仪）

分子生物学基本实验操作

⑴基因组DNA的分离与纯化（核酸浓度和纯度测定）

⑵真核细胞mRNA的分离与纯化

⑶质粒DNA的提取

⑷PCR基因扩增实验

⑸限制性内切酶酶切实验

⑹DNA重组技术

⑺DNA转移技术

⑻DNA测序：化学法、双脱氧链终止法

⑼核酸探针的制备技术：末端标记、PCR法制探针、非放射性探针

⑽分子杂交技术：Southern印迹、Northern印迹和Western印迹

微量移液器的使用

可调节微量移液器标准操作程序（适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液）：

⑴调节数字至所需体积；

⑵装上吸嘴（不同规格的移液器用不同的吸头），注意气密性）；

⑶按到第一档，垂直进入液面几毫米；

⑷缓慢松开控制按钮（否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸入移液器内部吸入体积减少）；

⑸停顿1s后将吸嘴提离开液面；

⑹平稳按压打出液体。注意吸嘴一般要贴壁并有一定角度，先按到第一档，稍微停顿1s后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。

⑺按吸嘴弹射按钮除去吸嘴；

⑻将量程调至最大量程处。

常见的错误操作：

⑴吸液时，移液器本身倾斜，导致移液不准确(应该垂直吸液，慢吸慢放)。

⑵装配吸头时，用力过猛，导致吸头难以脱卸(无需用力过猛，选择与移液器匹配的吸头)。

⑶平放带有残余液体吸头的移液器(应将移液器挂在移液器架上)。

⑷用大量程的移液器移取小体积样品(应该选择合适量程范围的移液器)。

⑸直接按到第二档吸液(应该按照上述标准方法操作)。

⑹使用丙酮或强腐蚀性的液体清洗移液器(应该参照正确清洗方法操作)。

三、作业

1.谈一谈微量移液器的使用方法及注意事项。

实验二碱裂解法制备质粒DNA

一、实验目的

掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理与方法。

了解碱裂解法中各种试剂的作用。

二、实验原理

基于染色体DNA与质粒DNA之间变性与复性的差异而达到分离质粒DNA的目的，因为①染色体DNA分子量比质粒DNA大得多；②从细胞中提取到的染色体DNA大多断裂成线状分子,而质粒DNA却是共价闭合环状结构。在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性，同时由于受到机械剪切力或核酸酶等的作用,染色体DNA易被切成大小不同的片段；而闭环质粒DNA链氢键虽也断裂，但因其超螺旋共价闭合环状结构，两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，质粒DNA又恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中，