串联重复核定位信号的绿色荧光蛋白融合载体的构建与原核表达.pdf

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维普资讯

第３３卷第４期贵阳医学院学报

Ｖ０１．３３Ｎｏ．４

２００８年８月

ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＧＵＩＹＡＮＧＭＥＤＩＣＡＬＣＯＬＬＥＧＥ２ｏ０８．８

串联重复核定位信号的绿色荧光蛋白融合载体的构

建与原核表达木

邓鹏，陈腾祥，龚小卫”

（南方医科大学病理生理学教研室，广东省蛋白质组学重点实验室，广东广州５１０５１５）

［摘要】目的：构建绿色荧光蛋白一串联重复核定位信号融合蛋白的表达载体（Ｈｉｓ．ＥＧＦＰ－３ｘＮＬＳ），并在原核

细胞中进行表达与纯化。方法：采用ＰＣＲ方法从原先克隆在ｐＥＧＦＰ－Ｃ１载体中的３ｘＮＬＳ与ＥＧＦＰ编码序列扩增

出来，使用常规酶切和连接方法将其重组至ｐＥＴ－１４ｂ载体中，对阳性克隆进行酶切、ＰＣＲ和测序鉴定。转化

ＢＬ２１（ＤＥ３）大肠杆菌株，用ＩＰＴＧ诱导融合蛋白表达，并利用Ｎｉ－ＮＴＡ亲和层析纯化该融合蛋白。结果：构建的

Ｈｉｓ．ＥＧＦＰ－３ｘＮＬＳ融合蛋白表达载体是正确的，该载体可在大肠杆菌内高效表达，用Ｎｉ－ＮＴＡ纯化获得了相对分

子质量约３６ｋＤ的融合蛋白。结论：成功构建了Ｈｉ—ｓＥＧＦＰ－３ｘＮＬＳ融合蛋白表达载体，并在原核细胞中获得了高

效表达和纯化，为进一步研究ＮＬＳ介导信号分子入核提供了实验材料。

［关键词］核定位信号；载体蛋白质类；基因表达；蛋白纯化

［中图分类号］８２［文献标识码］Ａ［文章编号］１０００－２７０７（２００８）０４－０３４０－０４

ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ

ＰｒｏｔｅｉｎＦｕｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｏｆＴａｎｄｅｍＮｕｃｌｅａｒＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎＳｉｇｎａｌｓ

ＤＥＮＧＰｅｎｇ，ＣＨＥＮＴｅｎｇｘｉａｎｇ，ＧＯＮＧＸｉａｏｗｅｉ

（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇ

Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０５１５，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆＨｉｓ－ＥＧＦＰ－３ｘＮＬＳｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｏｂ—

ｔａｉｎｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎＥ．ｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：３ｘＮＬＳａｎｄＥＧＦＰｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙ

ＰＣＲｆｒｏｍｐＥＧＦＰ—Ｃ１－３ｘＮＬＳｖｅｃｔｏｒａｎｄｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＥＴ－１４ｂｖｅｃｔｏｒｆｏｌｌｏｗｉｎｇｈｔｅｒｏｕｔｉｎｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．

Ａｆｔｅｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ＰＣＲｎａｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｈｔｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎ－

ｔｏＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓ，ｎａｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏＨｉｆｓ—ＥＧＦＰ－３ｘＮＬＳｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｉｎｄｕｃｅｄ

ｔｈＩＰＴＧｎａｄｆｕｒｔｈｅｒｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＮｉ—ＮＴＡａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄＨｉｓ—ＥＧ—

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