聚合酶链式反应技术及应用课件.pptxVIP

2024/12/8xxx1聚合酶链式反应技术及应用检验医学院生命科学学院

2024/12/8xxx2聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）技术是生命科学界的重大发明，是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。通过体外（试管内）扩增，可以将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，从而达到极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一个分子的水平。

2024/12/8xxx3PCR发展简史PCR的发明人，一般公认是凯利﹒穆利斯（K.Mullis,在Cetus公司工作期间，发明了PCR。1983年4月穆利斯萌发了PCR的构想;1985关于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上发表;1987当年7月Cetus公司在美国获得PCR基本技术专利批准,并于当年11月推出了第一个PCR试剂产品及第一台热循环仪；1989Science报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶的发现,预示着分子时代的到来；1990Cetus科学家D.Gelfand和S.Stoffel发明了纯化TaqDNA多聚酶的方法；1991TaqMan技术发表；九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开；1998年实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测。

2024/12/8xxx4引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段

2024/12/8xxx5KaryB.MullisTheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。

2024/12/8xxx6PCR的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他……

2024/12/8xxx7PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制，在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。2.PCR基本原理

2024/12/8xxx8模板DNA94℃变性55℃退火72℃引物延伸第二次循环模板变性退火延伸图6-1PCR原理示意图

2024/12/8xxx91234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍

2024/12/8xxx10PCR产物生成曲线扩增产物循环次数指数扩增期扩增平台期

2024/12/8xxx11PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个PFU(空斑形成单位)细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA

2024/12/8xxx12反应体系：（五要素）模板（template）引物(primer)人工合成的两段寡核苷酸序列，决定RCP的特异性。3.PCR反应体系和反应条件DNARNA：总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因组DNA质粒DNA

2024/12/8xxx13PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率，特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子；引发效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。

2024/12/8xxx14引物的长度典型的引物为18-24个核苷酸，在一定范围内引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性；引物长度的上限主要与反应效率有关，所以一般又不能太长，因为过长会导致其延伸温度大于72℃，即Taq酶的最适温度。引