实验大肠杆菌半乳糖苷酶诱导表达.pptVIP

马玉超北京林业大学生物科学与技术学院办公地点：生物楼117；电话现代微生物学实验技术实验内容?染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列?转座子随机突变及目的表型的筛选?大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达?利用SDS分析融合蛋白的可溶性?绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取0102大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达张妙直01.加深对大肠杆菌乳糖操纵子的理解；02.证实β-半乳糖苷酶是诱导表达的，且该酶的合成受到严格调控。实验目的实验原理乳糖操纵子调节基因结构基因ipozya控制单元操纵基因结构基因调节基因启动子阻遏物?-半乳糖苷酶透性酶乙酰基转移酶负调控模型诱导物：乳糖或IPTG实验原理操纵基因结构基因调节基因启动子?-半乳糖苷酶透性酶乙酰基转移酶操纵子正调控模型cAMP-CAP复合物CAP结合位点调节基因结构基因ipozya控制单元?无作用底物(乳糖或半乳糖苷)时，几个分子/细胞；1?中性培养基中加入乳糖(诱导物)，103~105倍；2?IPTG，不被分解，比乳糖提高~3倍；3?葡萄糖效应：葡萄糖和IPTG，被显著阻遏；4?葡萄糖+IPTG+cAMP，不受葡萄糖影响。5实验原理大肠杆菌β-半乳糖苷酶是一类诱导酶实验原理420nm下吸光度Β-半乳糖苷酶邻硝基苯酚-β-D-吡喃型半乳糖苷ONPG邻硝基苯酚ONP+乳糖实验材料菌株大肠杆菌(E.coliK12)2.培养基及试剂(1).基本培养基(M9培养基)KH2PO430g；Na2HPO460g；NaCl5g；NH4Cl10g。溶解后加水至1L，121℃灭菌20min。灭菌后，在100mlM9中加入：0.1mol/LMgSO410ml,0.01mol/LCaCl210ml,加无菌水至1L，作为基本培养基。(2).2×YT培养基蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl5g，加去离子水至1L。(3).Z缓冲液每升含有一下成分：Na2HPO4·12H2O(0.06mol/L)21.5gNaH2PO4·2H2O(0.04mol/L)6.2gKCl(0.04mol/L)(0.01mol/L)0.75gMgSO4·7H2O(0.001mol/L)0.246g巯基乙醇(0.05mol/L)2.7mlpH7.010%甘油，10%乳糖，10%葡萄糖，IPTG(200mg/ml),ONPG(4mg/ml),1mol/LNa2CO31%SDS,氯仿主要仪器可见光分光光度计，摇床(4).其他试剂实验步骤大肠杆菌中β-半乳糖苷酶的诱导合成菌悬液制备将E.coliK12接种到固体2×YT平板上进行活化，挑取单菌落接种至5ml2×YT液体培养基中，37℃培养过夜，2%的接种量接种至25ml甘油培养基中，37℃培养18h，作为下面实验接种用的种子液。分5组实验，准备5份种子液。注：平板不要大家准备周四晚上7点来接种—5ml试管周五下午两点来接种—25ml三角瓶酶的诱导合成及其调控分组进行，实验结束后全班集中整理出总的实验结果每组：A.25ml基本培养基的三角瓶21个2ml离心管，加入20μl0.1%SDS和μl氯仿，盖严后至于冰浴；10个2ml离心管，测OD600.第一组：乳糖对β-半乳糖苷酶的诱导第一组：乳糖对β-半乳糖苷酶的诱导(1).往25ml基本培养基的三角瓶中加1ml10%的甘油；(2).接种25ml生长在甘油培养基18h的菌液，计时，并取1ml测OD600；(3).30℃水浴摇床振荡培养1h，取1