分子医学实验 设计性实验学习课件.pptx

;检测羟肽酶A1酶原和白蛋白;实验目的及意义;实验原理;白蛋白又称清蛋白，是溶于水且遇热凝固的一种球形单纯蛋白。白蛋白的分子结构为含585个氨基酸残基的单链多肽，分子量为66458，分子中含17个二硫键，不含有糖的组分。在体液pH7.4的环境中，白蛋白为负离子，每分子可以带有200个以上负电荷。它的生理作用有：1、维持血浆胶体渗透压的恒定2、血浆白蛋白的运输功能3、解毒、功能、调节等等。

;实验方法选用;实验步骤;（一）检测羧肽酶A1酶原及白蛋白是否存在;SDS;分离胶的制备;浓缩胶的制备;加样

;电泳

;剥胶、染色和脱色

;检测;若存在Mr为40000的条带，则说明该组织存在羧肽酶A1，反之则无。

若存在Mr为66458的条带，则说明该组织存在白蛋白，反之则无。

此法为初步检测

;转膜;Westernblotting;验证;离心管编号;计算蛋白质浓度;Lowry法：

该法的原理主要是根据蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子结合形成复杂的络合物（类似双缩脲反应）。

由于蛋白质中酪氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与Folin－酚试剂形成蓝色复合物。

上述呈色反应色泽深浅皆与蛋白质含量成正比。因此通过比色，参照已知含量的标准蛋白质的比色标准曲线，可确定待测样品的蛋白质含量。;考马斯亮兰法：

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在一定范围内，考马斯亮兰G250-蛋白质复合物在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。;紫外吸收法测定蛋白质浓度：

蛋白质中普遍含有酪氨酸与色氨酸，由于这两种芳香族氨基酸分子中含有大π键，它们在280nm紫外光附近有光吸收。

因而使蛋白质在上述紫外波长附近产生较强的光吸收，利用蛋白质的这一特性可对其进行含量测定。;Lowry法;2．各管加入2.5mL新配制的碱性铜溶液，立即摇匀，在室温下放置10min。

3．各管加入0.5mLFolin酚试剂应用液，边加入边立即充分混合，然后在室温下放置30～60min（不要超过60min???。

4．将标准样品及待测样品在可见光光度计上在550nm波长下比色。

5．根据已知含量的标准样品测得的吸光度做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出小鼠组织提取液的蛋白质含量。;考马斯亮兰法测定蛋白质浓度;2．每管加入考马斯亮兰G250染料试剂3mL,摇匀，室温静置3分钟。

3．分光光度计于波长595nm比色。

4．根据已知含量的标准样品测得的吸光度做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出小鼠组织提取液的蛋白质含量。;紫外吸收法测定蛋白质浓度;2．以1号管为参比，用紫外分光光度计于波长280nm处比色。

3．根据已知含量的标准样品测得的吸光度做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算小鼠肝提取液的蛋白质含量。;数据处理;实验误差;Thankyou！