分子医学实验 蛋白质浓度测定学习课件.doc

专业：医学试验班类姓名：阮烨玲

专业：医学试验班类

姓名：阮烨玲

学号：3130101923

日期：2014年9月24日

地点：医学院教学楼B511

课程名称：医学生物化学实验指导老师：孙启明成绩：

实验名称：动物细胞蛋白质的提取和含量测定实验类型：生物化学同组学生姓名：翁益琴

一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）

三、主要仪器设备（必填） 四、操作方法和实验步骤

五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析（必填）

七、讨论、心得

一、实验目的

1.学习掌握从动物样品中提取细胞总蛋白的基本方法

2.掌握三种常用的蛋白质定量分析方法，并了解各自的优缺点

二、实验原理

（一）小鼠肝脏细胞蛋白质提取

蛋白质是生命现象的物质基础之一，是生物体最重要的组成部分。因此，对蛋白质的结构与功能研究，是生命科学的核心问题。要研究蛋白质的结构与功能，往往从细胞中提取蛋白质开始，而对蛋白质含量的测定则是蛋白质相关研究中的必备技术。

1.动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料。小鼠肝脏采用匀浆法将其破碎，然后加入样品提取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。收集上清液后可进行蛋白质定量分析。

2.蛋白质提取中最常见的问题是目的蛋白质发生变性和被蛋白酶降解。基本的防范措施是尽可能缩短提取时间和在尽可能低的温度下进行提取。

1)为了防止蛋白酶的破坏，可在提取液中加入蛋白酶抑制剂。例如加入苯甲磺酰氟（PMSF）可以抑制丝氨酸蛋白酶和某些半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂，可抑制酸性蛋白酶；乙二胺四乙酸（EDTA）可抑制金属蛋白酶。

2)为了防止蛋白质的巯基发生氧化，可加入一定量的还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇。考虑到溶液中如存在重金属离子（如铝、铜、铁离子）可能会与蛋白质形成不溶复合物，可在溶液中加入一定浓度的EDTA。

（二）蛋白质浓度的测定

1.目前蛋白质的含量测定常用的方法有定氮法、双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）、考马斯亮蓝法（Bradford法）和紫外吸收法。

其中Bradford法和Lowry法灵敏度较高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍。

上述这些方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定，有可能得出几种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。

在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。

1)Lowry法：

该法的原理主要是根据蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子结合形成复杂的络合物（类似双缩脲反应）。

由于蛋白质中酪氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与Folin－酚试剂形成蓝色复合物。

上述呈色反应色泽深浅皆与蛋白质含量成正比。因此通过比色，参照已知含量的标准蛋白质的比色标准曲线，可确定待测样品的蛋白质含量。

2)考马斯亮兰法：

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在一定范围内，考马斯亮兰G250-蛋白质复合物在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。

3)紫外吸收法测定蛋白质浓度：

蛋白质中普遍含有酪氨酸与色氨酸，由于这两种芳香族氨基酸分子中含有大π键，它们在280nm紫外光附近有光吸收。

因而使蛋白质在上述紫外波长附近产生较强的光吸收，利用蛋白质的这一特性可对其进行含量测定。

三、实验步骤

（一）小鼠肝脏细胞蛋白质提取

用颈椎脱臼法处死小鼠?切开腹腔，取下完整肝脏，小心去掉胆囊（不要弄破）?

放入盛冷生理盐水的烧杯中漂洗干净?取小鼠肝组织在滤纸上剪碎?放入玻璃匀浆管中?

1：15比例加入缓冲液7.5ml（预冷的提取缓冲液7.3mL，蛋白酶抑制剂0.2mL）?手动匀浆?

取两只1.5mLeppendorf管各加入1.2mL匀浆液?冷冻离心机4℃，13000rpm离心20分钟?

小心取出上清液至1.5mLeppendorf管中?放入塑料盒的冰块中，作为待测样品备用

（二）蛋白质浓度的测定

1.Lowry法

取16mm*150mm试管16支，标明号码?

1～6号试管分别加入标准牛血清白蛋白(0.5mg/mL)0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL?

双蒸水补足至0.5mL?7、8号试管内分别加入待测样品