乳及乳制品中牛乳酪蛋白成分定性检测-毛细管凝胶电泳法.docxVIP

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乳及乳制品中牛乳酪蛋白成分定性检测毛细管凝胶电泳法

1范围

本文件规定了牛乳、羊乳及其制品中牛乳酪蛋白成分毛细管凝胶电泳定性检测法，方法的最低检出限为1%（配料质量比）。

本文件适用于牛乳、羊乳及其制品中牛乳酪蛋白成分的定性检测，适用的产品类别包括液态乳（巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、调制乳、灭菌乳、发酵乳）、乳粉（全脂乳粉、脱脂乳粉、部分脱脂乳粉、调制乳粉、乳清粉）、婴幼儿配方乳粉等。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检验

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

毛细管凝胶电泳Capillarygelelectrophoresis(CGE)

将起分子筛作用的凝胶聚合物灌注于毛细管中，以高压直流电场为驱动力的对生物大分子进行分析检测的技术。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

4.1kD：kilodalton，千道尔顿。

4.2SDS：Sodiumdodecylsulfate，十二烷基硫酸钠。

4.3Tris：Tris（Hydroxymethyl）aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。

5生物安全措施

为了保护实验室人员的安全和防止污染，应由具备资格的工作人员检测，所有生物安全防护的设施、设备和安全管理的基本要求按照GB19489有关规定执行。

6方法原理

基于毛细管凝胶电泳的检测原理是通过SDS对样品中蛋白质组分进行变性和附加电荷的处理，采用毛细管电泳仪对蛋白质组分进行分离，依据牛乳酪蛋白特异性蛋白峰的信号，判定样品是否含有牛乳来源酪蛋白成分。

7仪器设备

7.1毛细管电泳仪：配备二极管阵列检测器或相同功能的仪器。

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7.2分析天平：精度0.1mg。

7.3水浴锅。

7.4离心机：离心力≥12000g。

7.5微量移液器：0.5μL～10μL，10μL～100μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。

7.6涡旋混匀仪。

7.7恒温孵育器。

7.8pH计。

8毛细管凝胶电泳测定方法

8.1方法提要

对于实时荧光PCR检出牛源性DNA成分的样品，可进一步采用毛细管凝胶电泳法检测牛源性酪蛋白成分。

8.2试剂和材料

8.2.1β-巯基乙醇。

8.2.2十二烷基磺酸钠（SDS）。

8.2.3SDS-MW凝胶缓冲溶液：pH=8，0.2%SDS140mL。

8.2.4SDS-MW样品缓冲液：100mmo/LTris-HCl（pH9.0），1%SDS50mL。

8.2.510kD蛋白内标，5mg/mL，0.4mL。

8.2.6分子量标记蛋白组标样（10kD～225kD），16mg/mL，100μL。

8.2.70.1mol/LHCl溶液：100mL，室温避光贮存。

8.2.80.1mol/LNaOH溶液：100mL，室温避光贮存。

8.2.9毛细管电泳分析预备液：以SDS-MW样品缓冲液与10kD蛋白内标为84:1的体积比例，按照当天准备分析样品数量加一的量配制毛细管电泳分析预备液。

8.3制样

8.3.1干粉或固态样品制备

称取一定量固态样品（配方乳粉、全脂乳粉500mg，乳清蛋白粉、脱脂乳粉、乳酪样品135mg），置于10mL离心管中，加入水到5mL刻度，涡旋振荡，至充分溶解并混合均匀（含有大约15mg/mL蛋白质），其中乳酪样品需在涡旋震荡前超声溶解5分钟。

8.3.2反应液配制

用移液器将10μL制备的样品溶液或液态乳样品（巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、调制乳、灭菌乳、发酵乳），移入至2.0mL离心管中，然后相继加入85μL毛细电泳分析预备液、5μLβ-巯基乙醇，混合并涡旋振荡，盖紧瓶盖。

8.3.3沸水浴

样品在100℃水浴中加热10min，冷却样品至室温，快速离心，使液体聚集至管底。

8.3.4上样

涡旋振荡，用移液器将90μL样品转移至200μLPCR管底部，注意避免气泡产生。将微量样品管插入通用样品瓶内，使用通用瓶盖并盖紧。

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