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AAV的包装纯化浓缩方法总结
腺相关病毒（adeno-associatedvirus，AAV）,也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒（通常为腺病毒）参与复制。它编码两个末端的反向重复序列（ITR）中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，?rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。rep基因产物存在时，病毒DNA很容易整合到人类第19号染色体。
重组腺相关病毒载体(rAAV)?源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。
实验步骤
1、准备HEK293T细胞：
提前一天分HEK293T细胞，包装时细胞密度85%-90%且细胞分布均匀，状态良好(即：显微镜下观察，培养基中无杂质，无细胞悬浮或有少量细胞悬浮，细胞饱满，在培养皿中贴壁均匀)。
2、包装病毒
1）提前一到两个小时给细胞换液，换成无血清的DMEM培养基（1%HEPES和1%P/S）。换液时移液管要靠近培养皿内壁但不要贴住培养皿内壁缓慢加入DMEM，防止将已经贴壁的细胞吹起，同时换液时应注意避免移液管污染换液用培养基及细胞。
2）转染：以5个15cm培养皿的量为例：
向15ml离心管中依次加入DMEM:9ml，Helper:124μg，RC:76μg，目的质粒：65.1μg，PEI:1ml，振荡混匀后室温静置30min。
辅助质粒和目的质粒需要根据其浓度换算出所需的体积，在加入之前要振荡混匀。
3）将上述静置后的液体平均加到5盘HEK293T细胞中并做好标记，加入时同样要贴壁缓慢加入，避免将细胞吹起，加入后摇晃混匀（水平十字混匀）。将细胞至于37℃，5％CO2培养箱中培养。
4）观察转染效率：
转染后24h观察转染效率，一般为60%-70%左右，看看所需荧光是否正确。
3、收毒
1）将细胞吹起，连同培养基一并收到50ml离心管中，每5盘细胞收集到3个50ml离心管中，平均每管45ml,3500rpm(2100g)常温离心7min。
2）将培养基上清转移到新管中，PEG8000沉淀过夜（每100mL加入2.33gNaCl+8.5gPEG8000），第二天离心3500g、4℃离心30min，弃掉上清（离心后马上弃去上清，防止病毒回溶），用2mlPBS+0.001%PF68?重悬。
3）将细胞沉淀用PBS+0.001%PF685ml重悬，冻融一次后加入5MNacl?（高压灭菌）2ml，涡旋混匀。
4）将2）的重悬液与3）的重悬液混合，振荡混匀后超声至不粘稠，超声时不同样品之间探头要依次经过84（用无菌水稀释10倍），75%酒精，灭菌水的清洗，超声30s停8~10s，根据样品的粘稠度不同AMPL30％超3-4次，AMPL20％超一次（用粗的探头）。转换超声强度是因为当用AMPL30%超声3-4次不粘稠后，如果再用30%的强度超声一次可能会因强度过强对病毒活性有一定的影响，换用20%AMPL?超声一次可以使超声更加充分。
5）将超声后的液体3500g、4℃?离心30min，将上清转移至新的离心管中。
4、纯化：碘克沙醇密度梯度离心
1）按如下的比例配置不同浓度的碘克沙醇。（用灭菌水配制60%碘克沙醇w/v,并用0.2μm的滤膜过滤至灭过菌的瓶中）
层数
60%碘克沙醇(ml)
5MNacl
(ml)
H2O
(ml)
2.5MKCl
(μl)
1MMgCl2
(μl)
10×PBS
(ml)
Total
(ml)
每管用量（ml）
15%
25
20
45
100
100
10
100
9
25%
41.7
0
48.3
100
100
10
100
6
40%
66.7
0
23.3
100
100
10
100
5
60%
100
0
0
100
100
0
100
4.2
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2）取一个超离管（超离管和盖子均高压灭菌后使用），逐层加入不同浓度的碘克沙醇。先加入60%层4.2ml，再加入40%层5ml，其次加入25%层6ml，后加入15%层9ml。加入不同浓度的碘克沙醇时要倾斜离心管并缓慢推入，避
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