13200l生物反应器实验报告.pdfVIP

200L生物反应器实验报告（BD、BD、

BD

1.细胞培养工艺描述

1.1细胞复苏

从工作细胞库（WorkCellBank，WCB）中取1支冻存的细胞，采用温水浴法

（35°C~37°C）解冻，并快速转移至装有9mlDF1SM培养基的离心管，室温下100

g离心10min，弃去上清，用预热的DF1SM培养基重悬细胞，转入125ml摇瓶，

培养体积为20ml，取0.5ml进行细胞密度和活率测定。DF1SM的培养基成份为

DF1S+0.2µMMTX。摇瓶置于二氧化碳培养摇床中培养，参数设置为温度：37.0°C，

CO2浓度：8.0%，摇床转速：125rpm。细胞复苏后可以接受的范围是：活细胞密

度≥0.3e6cells/ml；活率≥94.0%。

1.2摇瓶阶段扩培

复苏的细胞依次在125ml、500ml和2000ml的摇瓶中逐级扩大培养，

培养体积分别为20ml、60ml、200ml、1000ml，培养基为DF1SM，培养温度

37.0°C，CO2浓度8.0%，摇床转速：125rpm，每级的培养天数3~4天。20ml→60

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ml体积扩大标准是活细胞密度≥1.2×10cell/ml，活率≥89%，细胞生长达到该标准

后，按照0.4*106cell/ml进行扩培。60ml→200ml体积扩大标准是活细胞密度

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≥1.7×10cell/ml，活率≥90%，细胞生长达到该标准后，按照0.5*10cells/ml进行

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扩培。200ml→1L体积扩大标准是活细胞密度≥2.0×10cell/ml，活率≥90%，细胞

生长达到该标准后，进行下一步扩培。而1L→5L体积扩大标准是活细胞密度

≥2.0×106cell/ml，活率≥90%。

1.37L生物反应器阶段扩培

1000ml种细胞达到扩传标准后接入7L生物反应器（内有预运行的DF1S培

养基4L），培养体积扩大到5L，培养温度37.0°C，溶氧设置到50%，pH设置为

7.0±0.1，搅拌转速150rpm。DF1S培养基的成份为15.58g/LCDCHOGrow™CD

DF1无培养基+0.877g/L(6mM)L-Glutamine。

继续培养3天，当细胞符合下一级扩大的标准，即活细胞密度≥4.0×106cell/ml、

活率≥90%时，将细胞接入含50LDF1L的200L生物反应器。DF1L的培养基成份

与DF1S的相同，其区别只在于配制体积的大小，当小体积配制时给培养基命名

为DF1S；大体积配制时为DF1L。

每天取样测细胞密度和活率，实时搅拌速度、温度、pH、溶氧、底

层空气通量、氧通量、CO2通量和Na2CO3累积量，每天离线检查葡萄糖、乳酸、

谷氨酰胺、铵离子及产物含量，并校验pH值。

1.4200L生物反应器阶段扩培

7L生物反应器培养的细胞达到标准后接入200L生物反应器（内有预运

行的DF1L培养基50L），培养体积扩大至55L，继续培养，培养温度36.8°C，溶

氧设置到50%，pH设置为7.0±0.2，搅拌转速60rpm。培养3天后，当细胞符合

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下一级扩大的标准，即活细胞密度≥3.0×10cell/ml、活率≥90%时，加入95LDF1L

培养基，培养体积共计150L。

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