DotBlot检测流程_原创精品文档.pdfVIP

第九章免疫学活性测定

Dotblot原理：

原理：抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量

分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的

抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需

要不断监测，工作量很大。因此快速简洁的定量分析是检测细胞表达

水平监测的重要手段。主要监测方法包括Dotblot和ELISA。

Dotblot

Dotblot是最快速简捷的方法之一，简述如下：在超净台内，使

用无菌多孔加样器将96孔板内的细胞克隆培养液以5µL上样量，成

排点于硝酸纤维素膜上并风干，记录好样品顺序（可在膜的正面边缘

处标记正面及名称，也可通过在膜的右下角剪去一角作为标记，识别

膜的正反面及方向）。取上面风干好的硝酸纤维素膜，用配制好的封

闭液（脱脂奶粉或白蛋白溶液）室温震荡孵育至少一小时。此步骤的

目的是封闭硝酸纤维素膜上的非特异性蛋白结合位点，以避免下一步

加入的抗体与膜发生非特异性结合。将封闭好的硝酸纤维素膜浸泡在

第一抗体中，室温震荡孵育1小时，然后用TTBS溶液淋洗膜2遍后，

将膜浸泡到TTBS溶液中，室温震荡洗涤3次，每次5分钟。将洗涤

后的硝酸纤维膜浸泡在含有酶标第二抗体溶液中，室温震荡孵育1小

时，然后用TTBS溶液淋洗膜2遍后，将膜浸泡到TBST溶液中，室

温震荡洗涤3次，每次5分钟。最后，将膜浸于荧光显色剂（新鲜刚

刚混合的等量A和B液）。1-2分钟后将浸泡过的膜，抖去多余显色

剂，夹入保鲜膜（保鲜膜应薄而透明，以免阻挡曝光效果）中，同时

观察显色情况，确定大致曝光时间（一般情况下，如果样品亮度肉眼

可见且较强，那么初次曝光时间应较短，一般选3-5秒；如果样品亮

度肉眼不可见，则初次曝光时间应略长一些，一般选择1分钟），曝

光完毕，经显影，定影后，用清水冲洗X光胶片，根据胶片上结果

情况，再将膜放入曝光暗盒中进行二次曝光及显影、定影反应。溶液

配制及整个操作过程请斑点杂交操作流程图。Dotblot需要TTBS溶

解的倍比稀释后的标准品做对照方能进行半定量。同时样品倍比稀释

也是半定量所必需。

附1：Dot-Blot操作流程图

以

下

均

用

微

振

摇

床

混

和

一、试剂

1、抗待检样品抗体：

第一抗体为纯化鼠抗人IgGFc单抗；

第二抗体为HRP-兔抗小鼠IgG二抗。

2、封闭液（5%脱脂奶粉）

3、底物荧光显色剂A、B

4、TTBS(10×)缓冲液：取三羟甲基氨基甲烷(Tris)60.5g，NaCl45g，吐温

-805.5ml，加适量超纯水溶解，用浓盐酸(～32ml)调PH7.5，补加超纯水

至500ml。置于棕色瓶中，4℃保存，有效期6个月。用前10倍稀释为1

×TTBS缓冲液。

二、操作

1、取硝酸纤维素膜1张，将标准品倍比稀释、样品、阴性对照、阳性对照点

在膜上，风干。

2、将膜置于封闭液（5%脱脂奶粉溶于超纯水中）室温封闭1小时（也可4℃

过夜封闭）。

3、弃去封闭液后，加入含有待检样品第一抗体的TTBS缓冲液30mL（抗体稀

释度为1：1000），且其中含有1%的脱脂奶粉，室温震荡孵育1小时。

4、将硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液充分淋洗两次,每次洗后都尽量弃去溶液。

然后再用TTBS缓冲液震荡洗涤3次,每次5分钟。

5、弃去液体后，加入含有第二抗体的TTBS缓冲液30mL（抗体稀释度为1：

2000），室温震荡孵育1小时。

6、将硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液充分淋洗两次,每次洗后都尽量弃去溶液。

然后再